Antigen-Testabstriche sind vergleichbar mit Nasopharyngealabstrichen zur Sequenzierung von SARS

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11255 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Überwachung des Virusgenoms war ein wesentlicher Bestandteil der weltweiten Reaktion auf die SARS-CoV-2-Pandemie. Überwachungsbemühungen basieren auf der Verfügbarkeit repräsentativer klinischer Proben aus laufenden Testaktivitäten. Allerdings haben sich die Testpraktiken in letzter Zeit aufgrund der weit verbreiteten Verfügbarkeit und Verwendung von Antigen-Schnelltests verändert, was zu Lücken bei künftigen Überwachungsbemühungen führen könnte. Daher müssen Genomüberwachungsstrategien angepasst werden, um Laborabläufe einzubeziehen, die robust für den Probentyp sind. Zu diesem Zweck vergleichen wir die Ergebnisse der RT-qPCR und der viralen Genomsequenzierung unter Verwendung von Proben aus positiven BinaxNOW COVID-19 Antigen Card-Abstrichen (N = 555) mit denen, die aus Nasopharyngealabstrichen (NP) erhalten wurden, die für Nukleinsäureamplifikationstests verwendet wurden (N = 135). Wir zeigen, dass aus Antigenkarten gewonnene Abstriche in ihrer Leistung mit Proben aus NP-Abstrichen vergleichbar sind. Dies stellt eine praktikable Alternative dar und ermöglicht die potenzielle Ausweitung der viralen Genomüberwachung auf ambulante Kliniken sowie andere Einrichtungen, in denen häufig schnelle Antigentests eingesetzt werden.

Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) hat die entscheidende Rolle kontinuierlicher Tests und viraler Genomüberwachung für die öffentliche Gesundheit hervorgehoben, um neu auftretende Varianten zu verfolgen, die Übertragung zu verstehen, die virale Evolution mit Veränderungen in der Krankheitsepidemiologie zu verknüpfen, diagnostische Instrumente zu entwerfen und zu bewerten und die Wirksamkeit von Impfstoffen vorherzusagen der Kontext der viralen Vielfalt1,2. COVID-19, das durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, hat weltweit zu etwa 760 Millionen bestätigten Fällen und 6,9 Millionen Todesfällen geführt, wie die Weltgesundheitsorganisation (WHO)3 berichtet. Die Entwicklung des SARS-CoV-2-Genoms während der Pandemie hat zur kontinuierlichen Entstehung neuer Varianten mit erhöhter Übertragbarkeit, Krankheitsschwere und Fähigkeit zur Immunflucht geführt4,5,6. Seit der Veröffentlichung der ersten SARS-CoV-2-Genomsequenzen im Januar 20207 wurden über 15 Millionen Sequenzen über die Datenbank der Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID)8 geteilt und über 7 Millionen Nukleotidsequenzen im National Center for hinterlegt Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/) bis zum 29. Mai 2023. Die beispiellosen Bemühungen, die Virusentwicklung von SARS-CoV-2 zu überwachen, haben den Ansatz dazu nachhaltig verändert Genomüberwachung von Krankheitserregern weltweit.

Ansätze zur Genomsequenzierung von SARS-CoV-2 wurden am häufigsten auf positive diagnostische Proben aus Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) angewendet. Der Goldstandard und die am weitesten verbreitete NAAT ist die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Da sowohl Virussequenzierungsansätze als auch RT-PCR virales Genommaterial direkt amplifizieren, überschneiden sich die Sammelmethoden und Reagenzien sowie die nachgelagerten Protokolle, was es zu einem nützlichen Ansatz für die Genomüberwachung macht. Dies war ein wirksamer Ansatz, da RT-PCR zu Beginn der Pandemie der am weitesten verbreitete Ansatz war.

Die Testlandschaft hat sich im Laufe der Pandemie jedoch erheblich in Richtung schneller Diagnosetests (RDTs) verändert, am häufigsten Antigen-basierte Lateral-Flow-Tests (LFTs). Mittlerweile gibt es weltweit mehr als 400 kommerziell erhältliche RDTs für SARS-CoV-29,10 und mehrere Antigen-basierte LFTs sind in den USA durch eine Notfallzulassung (EUA) für rezeptfreie Heimtests zugelassen11. Antigenbasierte Assays erkennen spezifische virale Proteine oder das Virus direkt ohne PCR-Amplifikationsschritte12. Die Vielseitigkeit von LFTs für eine breite Anwendung in Schulen, Kliniken und häuslichen Umgebungen hat ihren Einsatz deutlich erhöht. Darüber hinaus haben die USA in dem Bemühen, die Erkennung von COVID-19 zu verbessern, LFTs im Versandhandel frei verfügbar gemacht und anschließend bis März 2022 über 270 Millionen Testkits verteilt13. Die Empfindlichkeit antigenbasierter LFTs ist vergleichsweise geringer als die von NAATs, insbesondere in Fälle von geringer Viruslast oder asymptomatischer Infektion9,14,15,16,17,18; Wenn der Test jedoch innerhalb von 5–7 Tagen nach Beginn bei symptomatischen Personen angewendet wird, kann er eine Sensitivität von 99,2 % und eine Spezifität von 100,0 % erreichen19. Im Vergleich zu NAATs schneiden LFTs gut bei Viruslasten ab, die einem RT-qPCR-Ct-Wert ≤ 33 Zyklen entsprechen20,21,22.

Da eine robuste virale genomische Überwachung von der Gewinnung positiver Fälle durch Tests abhängt, werden sich Änderungen in der Testpraxis auf die Überwachungsbemühungen auswirken, wenn die Arbeitsabläufe im Labor nicht auf den Probentyp abgestimmt sind. Von besonderem Vorteil wäre die Möglichkeit, zuvor gesammelte Abstriche von positiven LFTs für die Genomanalyse zu verwenden. Da sich die Testpraktiken in den USA und im Ausland weiter verändern, wird ein größerer Anteil der Tests über LFTs durchgeführt. Die Fähigkeit zur Sequenzierung aus LFTs wird es Forschern ermöglichen, repräsentative Virusproben zu erhalten, die den geografischen und epidemiologischen Bereich der Pandemie abdecken, während die Bemühungen zur Überwachung des Virusgenoms in den folgenden Phasen der Reaktion fortgesetzt werden. Darüber hinaus wird es wahrscheinlich mehr LFT-Tests außerhalb des Gesundheitswesens geben. Diese Änderung könnte die verfügbaren Proben für die Überwachung des viralen Genoms erheblich reduzieren und die verfügbaren Proben nur auf die Tests beschränken, die in einem klinischen Umfeld durchgeführt werden, was zu einer Verzerrung hin zu schwereren Fällen führen würde. Die Entnahme von Proben aus LFTs würde die Darstellung der genomischen Überwachung erweitern. Zu diesem Zweck verglichen wir die Möglichkeit, aus LFTs entnommene Abstriche für die Sequenzierung des viralen Genoms zu verwenden, mit Nasopharyngealabstrichen (NP), die für NAATs verwendet werden. In erster Linie wollten wir feststellen, ob das Extraktionsreagenz oder eine andere Komponente der Probenverarbeitung, die für den BinaxNOW COVID-19 Ag Card-Test verwendet wird, die Fähigkeit zur Durchführung der SARS-CoV-2-Genomsequenzierung beeinträchtigt.

Von den 690 Proben wiesen 611 basierend auf den RT-qPCR-Ct-Werten nach der RNA-Extraktion nachweisbare Viren in der Probe auf. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen NAAT-Proben und LFT, die sich nicht amplifizieren konnten, wobei ein größerer Anteil der LFT-Proben erfolgreich extrahiert wurde (80,7 % N = 109 NAAT-Proben gegenüber 90,5 % N = 502 LFT, p < 0,00001) (Abb. 1A). Unter den Proben, die nachweisbare Viren aufwiesen, verglichen wir die RT-qPCR-Ct-Werte und fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen NAAT- und LFT-Proben (Median von 21,7 für NAAT und 21,9 für LFT, p = 0,27) (Abb. 1B).

Diagramme, die den Vergleich der Sequenzierungsqualitätsmetriken zwischen NAAT- und LFT-Abstrichen zeigen. (A) Balkendiagramm der Abstrichtypanzahl nach RT-qPCR-Ergebnis. (B) Proben mit nachweisbarem Virus entsprechend der Abstrichart anhand des Ct-Werts. Die entsprechenden p-Werte werden in jedem Panel angegeben.

Unter Verwendung eines Cut-off-Ct-Werts von ≤ 30 wurden 519 Proben (78 NAAT und 390 LFT) zur viralen Genomsequenzierung weitergeleitet. Anschließend stellten wir fest, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen NAAT- und LFT-Proben hinsichtlich des Anteils fehlgeschlagener Sequenzierung gab (8,1 % NAAT vs. 10,3 % LFT, p = 0,48) und nur einen mäßig signifikanten Unterschied in der mittleren Sequenzierungsabdeckung (Median von 183 für NAAT). vs 199 LFT, p = 0,0018) (Ergänzende Abbildung 1A). Die Abstammungszuordnungen für sequenzierte Proben sind in Abb. 2 dargestellt. Die meisten Proben (96,2 %) wurden der SARS-CoV-2-Omicron-Variante (BA.1 und BA.1.1) zugeordnet.

Abstammungsverteilung für die sequenzierten Proben, stratifiziert nach Abstrichtyp. Das Diagramm zeigt die Verteilung der verschiedenen SARS-CoV-2-Variantenlinien für jeden Abstrichtyp.

Beim Vergleich der Zeit von der Probenentnahme bis zur RNA-Extraktion wurde festgestellt, dass die Zeit bis zur Extraktion bei LFT-Proben aufgrund der Logistik unseres Probengewinnungsprozesses deutlich kürzer war (Median von 20 Tagen für NAAT gegenüber 6 Tagen für LFT, p < 0,00001) (Ergänzende Abbildung). . 1B). Um die Auswirkung der Zeit bis zur Extraktion auf die Ergebnisse zu beurteilen, haben wir die Ergebnisse für jeden Stichprobentyp unabhängig verglichen. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in der Zeit bis zur Extraktion für bestandene oder nicht bestandene Ergebnisse bei NAAT-Abstrichen (Median von 19 Tagen für bestanden vs. 23 für nicht bestanden, p = 0,15) (ergänzende Abbildung 1C) oder LFT-Abstrichen (Median von 6 Tagen für). bestanden vs. 7 für nicht bestanden, p = 0,16) (Ergänzende Abbildung 1D).

Trotz unseres fehlenden Zusammenhangs zwischen der Zeit bis zur Extraktion und den Sequenzierungsergebnissen wollten wir dennoch den Einfluss der unterschiedlichen Zeit bis zur Extraktion zwischen NAAT- und LFT-Abstrichen ausschließen; Wir haben daher eine Unteranalyse durch Downsampling basierend auf der Zeit bis zur Extraktion durchgeführt. Wir beschränkten die Teilprobe auf Proben mit einer Extraktionszeit von 14 bis 21 Tagen. Dies führte zu 41 NAAT-Abstrichen und 44 LFT-Abstrichen, von denen 35 NAAT- und 38 LFT-Abstriche nachweisbare Ct-Werte aufwiesen, ohne signifikanten Unterschied im Versagen je nach Abstrichtyp (p = 0,6). Nach Unterteilung der Daten betrug die mittlere Zeit bis zur Extraktion sowohl für NAAT- als auch für LFT-Abstriche 16 Tage ohne signifikanten Unterschied (p = 0,352) (ergänzende Abbildung 2A). Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied in der Zeit bis zur Extraktion bei Proben, die keine NAAT- oder LFT-Abstriche amplifizierten (ergänzende Abbildung 2B). Für die Teilprobe unterschieden sich die RT-qPCR-Ct-Werte wiederum nicht signifikant zwischen NAAT- und LFT-Abstrichen (Median von NAAT 19,9 gegenüber 20,9 für LFT, p = 0,404) (ergänzende Abbildung 2C). Unter Verwendung eines Cutoff-Ct-Werts von ≤ 30 wurden 35 (85 %) NAAT- und 38 (86 %) LFT-Proben zur Sequenzierung weitergeleitet. Es gab auch keinen signifikanten Unterschied im Anteil der Proben aus der Teilmenge, bei denen die Sequenzierung fehlschlug, oder in der Sequenzierungsabdeckung zwischen den erfolgreich sequenzierten Proben (ergänzende Abbildung 2D). Die statistische Signifikanz der Unteranalyse blieb beim Bootstrapping der Untergruppen zur Generierung von Gruppen von 100 für jeden Vergleich unverändert, was uns zu der Annahme veranlasste, dass die kleineren Stichprobengrößen signifikante Änderungen nicht verschleierten.

Um die Auswirkung der Zeit bis zur Extraktion auf die Abdeckung und die RT-qPCR-Werte weiter zu untersuchen, führten wir eine Spearman-Rangordnungskorrelationsanalyse durch. Wir haben keine signifikante Korrelation zwischen der Zeit bis zur Extraktion und den RT-qPCR-CT-Werten in den Gesamtdaten (R = − 0,02, p = 0,65) oder den Teildaten (R = 0,09, p = 0,52) festgestellt. Es gab auch keine signifikante Korrelation zwischen der Zeit bis zur Extraktion und der Abdeckung im Gesamtdatensatz (R = − 0,02, p = 0,7) oder den Teildaten (R = − 0,22, p = 0,1).

Durch die Sequenzierung von Proben aus NAAT-NP-Abstrichen und Proben aus positiven BinaxNOW-COVID-19-Ag-Card-Abstrichen und den Vergleich der Anteile erfolgreicher Sequenzierung, Genomabdeckung und RT-qPCR-Ct-Werte zeigen wir, dass Extraktionsreagenzien und Probenverarbeitung keinen wesentlichen Einfluss haben die Fähigkeit, SARS-CoV-2-Virusgenome wiederherzustellen. Dies legt nahe, dass positive LFT-Abstriche eine praktikable Alternative zur Genomüberwachung darstellen könnten. Beim Vergleich der Sequenzierungsergebnisse von LFT-Karten mit NAAT-Abstrichen gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Anteil fehlgeschlagener Proben, der Genomabdeckung oder den RT-qPCR-Ct-Werten. Wir haben beobachtet, dass die Extraktionszeit der NAAT-Proben deutlich, wenn auch geringfügig, länger war als die der LFT-Proben. Wir haben jedoch keine signifikante Korrelation zwischen der Zeit bis zur Extraktion und der Genomabdeckung oder den RT-qPCR-Ct-Werten beobachtet, was bedeutet, dass der Unterschied in der Zeit bis zur Extraktion keine offensichtlichen Auswirkungen hat. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sequenzierung positiver LFT-Abstriche die herkömmliche Sequenzierung von NAAT-Abstrichen ergänzen und gleichzeitig eine sehr ähnliche Sequenzierungsqualität liefern könnte. Die erhöhte Fähigkeit, virale RNA aus LFTs zu extrahieren und zu amplifizieren, steht im Einklang mit ihrer Testleistung, da frühere Studien gezeigt haben, dass sie mit größerer Wahrscheinlichkeit positive Ergebnisse bei höheren Viruslasten melden, die RT-qPCR-Ct-Werten < 30 entsprechen. Dies könnte teilweise eine Erklärung sein der große Erfolg bei der viralen Genomsequenzierung aus positiven LFT-Abstrichen.

Die Möglichkeit, Abstriche von RDTs für die Sequenzierung des SARS-CoV-2-Genoms zu verwenden, ist wichtig für zukünftige Überwachungsbemühungen. Da RDTs wie die BinaxNOW COVID-19 Ag Cards immer zugänglicher und allgegenwärtiger werden, werden NP-Abstriche zunehmend auf einen klinischen Bereich beschränkt, in dem NAATs routinemäßig eingesetzt werden. Diese Änderung könnte die genomischen Überwachungsdaten möglicherweise auf schwerwiegendere Fälle ausrichten, die eine klinische Intervention erfordern. Die Erfassung von Proben aus RDTs, die zu Hause oder in der Klinik durchgeführt werden, würde es uns ermöglichen, repräsentativere Überwachungsdaten zu generieren. Darüber hinaus machen wir durch die Verwendung klinischer Überschüsse aus zuvor gesammelten Abstrichen auch die Notwendigkeit der Entnahme eines zweiten Abstrichs überflüssig, was die IRB-Protokolle für klinische Studien vereinfachen und die Studienteilnahme erhöhen kann. Die Zukunft rezeptfreier RDTs wird vom Verlauf der Pandemie abhängen. Während die COVID-19-Notstandserklärung im Bereich der öffentlichen Gesundheit im Mai 2023 abgelaufen ist, bleibt die EUA, die ihre Verwendung erlaubt, in Kraft. Von nun an müssen Hersteller für die weitere Verwendung eine formelle FDA-Zulassung beantragen. Es scheint jedoch, dass der weit verbreitete Einsatz von RDTs während der Pandemie einen Paradigmenwechsel für die Verfügbarkeit von Tests auf Infektionskrankheiten zu Hause und in der Klinik bedeuten könnte, und wir sind der Meinung, dass unsere Ergebnisse Überwachungsstrategien für epidemiologisch ähnliche Krankheitserreger beeinflussen könnten, für die RDTs eingesetzt werden sind derzeit beschäftigt. Unbestreitbar hat die Verfügbarkeit rezeptfreier RDTs der Öffentlichkeit Entscheidungsfreiheit verschafft und es Einzelpersonen ermöglicht, Tests zur Steuerung ihres persönlichen Risikos und zur Unterstützung bei der Entscheidungsfindung zu nutzen. Denkbar wäre eine Ausweitung der Heimtests auf andere Atemwegserreger wie das Influenzavirus oder das Respiratory Syncytial Virus (RSV), die häufig ambulant mithilfe von Antigen-Schnelltests diagnostiziert werden. Angesichts dieser Möglichkeit müssen wir die Zukunft der viralen Genomüberwachung überdenken, damit die Stichprobe von Fällen in der Gemeinschaft robust bleibt.

Eine mögliche Lösung für den Erhalt von Proben aus Tests zu Hause wäre die Zusammenarbeit mit dem kostenlosen COVID-19-Testprogramm der Regierung für zu Hause, um einer Teilstichprobe von Empfängern vorfrankierte Porto- und Versandbehälter mit viralen Transportmedien (VTM) zur Verfügung zu stellen, die verwendet werden könnten positive Proben an Sequenzierungszentren zu senden. Auch eine Vergütung könnte als Anreiz zur Teilnahme in Betracht gezogen werden. Während die Lagerungs- und Transportbedingungen zu Hause erheblich variieren können, bieten Gentests direkt an den Verbraucher durch Unternehmen wie 23andMe und AncestryDNA ein Modell für die Sammlung und den Transport von Proben mit der beabsichtigten Anwendung der Sequenzierung. Darüber hinaus haben mehrere Studien die Stabilität von SARS-CoV-2-RNA unter verschiedenen Lager- und Transportbedingungen mit und ohne Transportmedium und Kühllagerung ausführlich untersucht. In der Studie von Alfaro-Nunez et al. fanden sie heraus, dass virale RNA auf trockenen, nicht gepufferten Abstrichtupfern bis zu 26 Tage lang stabil blieb, wenn sie bei Raumtemperatur belassen wurden23. Ähnliche Studien ergaben, dass die qRT-PCR-Ct-Werte bei Proben, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder VTM bei Raumtemperatur gelagert wurden, bis zu 28 Tage lang stabil blieben, unabhängig von der Viruslast24,25,26,27. Während sich diese Studien weitgehend auf die qRT-PCR-Leistung konzentrierten, wurde die Robustheit der SARS-CoV-2-Genomsequenzierung durch die Fähigkeit demonstriert, virale Genome aus scheinbar komplexen oder minderwertigen Proben, einschließlich Abwasser und Umweltoberflächen, erfolgreich zu rekonstruieren28,29. Beim derzeitigen Stand der Heimtests würde selbst eine bescheidene Sequenzierungsfehlerrate von Proben, die über ein Mail-In-Programm gesammelt wurden, die gemeinschaftsbasierte Genomüberwachung erheblich verbessern. Im ambulanten Gesundheitswesen sind Grundversorgungskliniken, die RDTs durchführen, wie in dieser Studie beschrieben für die Sammlung und Lagerung von Proben ausgestattet und würden eine brauchbare Quelle für gemeindenahe Probenentnahmen darstellen, ähnlich wie das US Outpatient Influenza-like Illness Surveillance Network (ILINet) des CDC.

Unsere Studie ist nicht ohne Einschränkungen. Aufgrund des Beobachtungscharakters unserer Studie sind wir nicht in der Lage, den Sequenzierungserfolg verschiedener Probentypen desselben Teilnehmers direkt zu vergleichen. Darüber hinaus haben wir weder die Impfhistorie noch den Schweregrad der Erkrankung berücksichtigt, die je nach Einrichtung variieren können (z. B. NAAT: Krankenhaus, RDT: Klinik); Allerdings war die Studienpopulation, aus der diese Proben entnommen wurden, im Allgemeinen gesund und litt wahrscheinlich an einer leichten Erkrankung. Bitte beachten Sie, dass Proben, bei denen die Sequenzierung fehlschlägt, möglicherweise auf technische Fehler bei der Bibliotheksvorbereitung zurückzuführen sind. Wir gehen jedoch davon aus, dass dieser Effekt unabhängig von der Art des Abstrichtupfers ist. Darüber hinaus berichten wir über einen signifikanten Unterschied in der Zeit bis zur RNA-Extraktion zwischen den beiden Gruppen. Um dieses Problem zu entschärfen, führten wir unsere Analyse anhand einer Teilmenge der Gesamtdaten durch, bei der die Zeit bis zur Extraktion zwischen 14 und 21 Tagen betrug. Diese Teilmenge führte zu einer ähnlichen Anzahl von Proben zwischen den beiden Gruppen mit ähnlicher Zeit bis zur Extraktion. Schließlich wurden in unserer Studie positive Abstrichtupfer der BinaxNOW COVID-19 Ag-Karte von der Karte entfernt, in Transportmedien gelegt und bis zum Transport ins Labor in einem Klinikkühlschrank aufbewahrt. Während dieses Protokoll in Kliniken und ambulanten Einrichtungen funktionieren mag, ist es für Tests zu Hause möglicherweise nicht gut geeignet, sodass die Frage der Realisierbarkeit in der Praxis unbeantwortet bleibt. Tatsächlich haben wir die Auswirkung unterschiedlicher Transport- und Lagerbedingungen auf die Sequenzierung viraler Genome nicht systematisch bewertet; Die oben beschriebenen früheren Studien haben jedoch gezeigt, dass die virale RNA-Stabilität von der Lagerdauer und dem Lagerzustand abhängt23,27,30. Während nachfolgende Studien mit parallelen Probenentnahmen derselben Person oder einer Vielzahl derzeit vermarkteter RDTs diese Einschränkungen beheben könnten, glauben wir, dass unsere aktuelle Studie die Fähigkeit demonstriert, SARS-CoV-2 erfolgreich aus Abstrichen zu sequenzieren, die für LFTs verwendet werden. Insgesamt zeigen wir, dass die Sequenzierung von LFT-Abstrichen nicht nur möglich ist, sondern auch zu vergleichbaren RT-qPCR-Ct-Werten, Genomabdeckung und Sequenzierungsfehlerraten führt. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für eine gemeindebasierte virale Genomüberwachung, die es der öffentlichen Gesundheit ermöglichen wird, repräsentative Probenahmefälle beizubehalten, während wir unsere Bemühungen zur Eindämmung der Pandemie fortsetzen.

Insgesamt wurden 690 Testabstriche aus NP-Proben aus NAAT-positiven Tests, die mit dem BioFire Torch unter Verwendung des Respiratory 2.1-Panels durchgeführt wurden (im Folgenden als NAAT bezeichnet, N = 135), oder aus positiven BinaxNOW-Schnellantigen-LFTs (N = 555) entnommen. Zwischen Oktober 2021 und Februar 2022 wurden NP-Abstriche von Kindern gesammelt, die in einem örtlichen Krankenhaus in Orlando, Florida, Pflege suchten. Positive NP-NAAT-Abstriche wurden in Zymo Research DNA/RNA Shield VTM gelegt und bis zum wöchentlichen Termin bei 4 °C in der Gesundheitseinrichtung gelagert abholen. Anschließend wurden die Proben gemäß den Vorschriften des US-Verkehrsministeriums für gefährliche Materialien in einem Styroporkühler und Eis zum Forschungslabor transportiert und anschließend bis zur RNA-Extraktion bei 4 °C gelagert. LFT-Abstriche wurden hauptsächlich von Personen im College-Alter gesammelt, die im gleichen Zeitraum, von Oktober 2021 bis Februar 2022, Pflege in der Klinik des Studentengesundheitsdienstes suchten. BinaxNOW-Schnellantigen-LFTs wurden entsprechend der Herstellung vorgefertigt, was das Einführen des Abstrichs der vorderen Nasenhöhle erfordert direkt in die Testkarte. Nach der Identifizierung positiver Proben wurden Abstrichtupfer von den Testkarten entfernt, in den DNA/RNA-Schutz von Zymo Research gelegt und bis zur täglichen Abholung bei 4 °C in der Klinik gelagert. Die Abstrichtupfer wurden per Kurier zum Forschungslabor transportiert, das sich neben der Klinik befand, und bis zur RNA-Extraktion bei 4 °C gelagert.

Die RNA-Extraktion für alle Proben wurde mithilfe der automatisierten Plattform QIAamp 96 Virus QIAcube HT Kit durchgeführt. Unsere RT-qPCR-Reaktionen wurden in einer 10-μL-Reaktion unter Verwendung von 4 × TaqPath-Mastermix (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) und jeweils 0,25 μM 2019-nCoV_N1(CDC) qPCR-Sonde (5′-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1) durchgeführt -3′), Vorwärtsprimer (5′-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3′) und Rückwärtsprimer (5′-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3′), 4,25 μl H2O in molekularer Qualität und 2,5 μl Matrizen-RNA. RT-qPCR wurde auf einem CFX Opus 96-Gerät (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: UNG-Inkubation bei 25 ° C für 2 Minuten; Reverse-Transkriptionsschritt bei 50 °C für 15 Minuten, gefolgt von Polymeraseaktivierung bei 95 °C für 2 Minuten und schließlich 35 Amplifikationszyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und 55 °C für 30 Sekunden. Alle Proben wurden im Duplikat getestet, einschließlich Positivkontrollen und Kontrollen ohne Vorlage.

Für die Sequenzierung wurden Proben mit RT-qPCR-Ct-Werten ≤ 30 ausgewählt. Die Proben wurden gemäß dem Midnight RT-PCR-Erweiterungspaket (EXP-MRT001) von Oxford Nanopore Technologies zusammen mit dem Protokoll Rapid Barcoding Kit 96 (SQK-RBK110.96) vorbereitet und sequenziert. Kurz gesagt, die virale cDNA wurde revers transkribiert, gefolgt von einer gekachelten PCR-Amplifikation, einer schnellen Barcode-Ligation, einem Pooling und einer Reinigung der SPRI-Kügelchen. Bibliotheken wurden mithilfe von Flusszellen (R9.4.1) mit dem GridION sequenziert. Base-Calling und Demultiplexing wurden in Echtzeit mit der GridION-Software durchgeführt. Der Zusammenbau wurde in zwei Schritten (unter Verwendung von Standardparametern) gemäß dem Bioinformatikprotokoll des ARTIC Network (https://artic.network/ncov-2019/ncov2019-bioinformatics-sop.html) durchgeführt. Das gupplyplex-Skript wurde zur Qualitätskontrolle und Filterung von Lesevorgängen (Fragmente 1000–1500 bp) verwendet, gefolgt von der Assemblierung mit der MinION-Pipeline, wobei Medaka zum Aufrufen von Varianten verwendet wurde, mit Wuhan-Hu-1-Referenz (GenBank-Zugangsnummer MN908947.3). Anschließend verwendeten wir das Pangolin-Softwaretool, um die Abstammungslinie jeder Probe zuzuordnen.

Um die Eignung von Proben aus positiven Antigen-Schnelltests für die Verwendung bei der viralen Genomsequenzierung zu bewerten, verglichen wir die virale RNA-Extraktion, RT-qPCR und den Sequenzierungserfolg mit Proben, die aus dem klinischen Überschuss positiver NAATs entnommen wurden. Wir haben zunächst statistisch signifikante Unterschiede zwischen dem Entnahmedatum und dem Datum der viralen RNA-Extraktion zwischen den beiden Proben untersucht. Anschließend verglichen wir die Häufigkeit der Proben, die während der RT-qPCR nicht amplifiziert wurden, und die resultierenden Zyklusschwellenwerte (Ct) unter den Proben, die amplifizierten. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Menge des viralen Ziels in der Probe – niedrigere Ct-Werte sind mit einer größeren Virusmenge und höhere Werte mit einer geringeren Menge verbunden. Zuletzt bewerteten wir den Sequenzierungserfolg (fehlgeschlagene Proben, virale Genomabdeckung und Genome, die die Sequenzierungs-QC bestanden) zwischen den beiden Gruppen. Die Chi-Quadrat-Statistik wurde verwendet, um die Häufigkeiten zwischen Kategorien zu vergleichen (z. B. bestanden/nicht bestanden für NAAT vs. LFT), und der Mann-Whitney-U-Test31 wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Werte zwischen zwei Gruppen signifikant unterschiedlich groß waren. Darüber hinaus haben wir für die Unteranalyse, die den möglichen Zusammenhang zwischen Zeit und Extraktion auf die Sequenzierungsergebnisse bewertet, die Robustheit des Mann-Whitney-U-Tests für unsere Stichprobengröße getestet, indem wir die Untergruppen (41 bzw. 44) gebootstrappt haben, um zwei zu generieren Gruppen von 100 für jeden Vergleich und erneute Durchführung des statistischen Tests und wir stellten fest, dass die Signifikanz, definiert durch einen p-Wert < 0,05, keinen Einfluss hatte. Alle statistischen Analysen wurden mit Python 3.10.232 durchgeführt. Alle Visualisierungen wurden mit Rstudio mit Version 3.6.033 erstellt.

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board der University of Central Florida geprüft und erhielt die Einstufung als nichtmenschliches Subjekt.

Alle in dieser Studie erstellten Daten stehen den Autoren auf begründete Anfrage zur Verfügung. Die für diese aktuelle Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind in GISAID verfügbar und die Zugangs-IDs sind zusammen mit zusätzlichen Metadaten in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Mercer, TR & Salit, M. Tests im großen Maßstab während der COVID-19-Pandemie. Nat. Rev. Genet. 22, 415–426 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, Z. et al. Globale Landschaft der genomischen Überwachung und des Datenaustauschs von SARS-CoV-2. Nat. Genet. 54, 499–507 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

WER. Weltgesundheitsorganisation. Dashboard zur Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). https://covid19.who.int/. Zugriff im Mai 2023.

Tegally, H. et al. Nachweis einer besorgniserregenden SARS-CoV-2-Variante in Südafrika. Natur 592, 438–443 (2021).

Artikel CAS PubMed ADS Google Scholar

Tang, JW, Tambyah, PA & Hui, DS Auftreten einer neuen SARS-CoV-2-Variante im Vereinigten Königreich. J. Infizieren. 82, e27–e28 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Faria, NR et al. Genomik und Epidemiologie der P.1 SARS-CoV-2-Linie in Manaus, Brasilien. Wissenschaft 372, 815 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Wu, F. et al. Ein neues Coronavirus, das in China mit Atemwegserkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht wird. Natur 579, 265–269 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Elbe, S. & Buckland-Merrett, G. Daten, Krankheit und Diplomatie: GISAIDs innovativer Beitrag zur globalen Gesundheit. Globus. Herausforderung. 1, 33–46 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Drain, P. et al. Durchführung des mikrofluidischen Immunfluoreszenz-Point-of-Care-SARS-CoV-2-Antigentests von Lumiradx bei asymptomatischen Erwachsenen und Kindern. Bin. J. Clin. Pathol. 157, 602–607 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yüce, M., Filiztekin, E. & Özkaya, KG COVID-19-Diagnose: Ein Überblick über aktuelle Methoden. Biosens. Bioelektron. 172, 112752 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

FDA. Notfallgenehmigungen für die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) für medizinische Geräte. EUAs von Vitro Diagnostics. https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas. Zugriff im August 2020 (2020).

Green, K. et al. Welche Tests könnten potenziell für das Screening, die Diagnose und die Überwachung von COVID-19 eingesetzt werden und welche Vor- und Nachteile haben sie? 2 NIHR Newcastle In Vitro Diagnostics Co-operative Newcastle upon Tyne NHS Hospitals Foundation Trust, Newcast. In: Das Zentrum für evidenzbasierte Medizin entwickelt, fördert und verbreitet bessere Erkenntnisse für die Gesundheitsversorgung, Bd. 13 (2019).

USPS. Der US-Postdienst hat mehr als 270 Millionen COVID-19-Testkits an amerikanische Haushalte geliefert. https://about.usps.com/newsroom/national-releases/2022/0302-usps-delivered-more-than-270million-covid-19-test-kits.htm. USPS-Nachrichten (2022).

Jääskeläinen, AE et al. Evaluierung von drei schnellen Lateral-Flow-Antigen-Nachweistests zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. J. Clin. Virol. 137, 104785 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindner, AK et al. Besorgniserregende SARS-CoV-2-Variante B.1.1.7: Diagnostische Sensitivität von drei Antigen-Nachweis-Schnelltests. Mikrobiol. Spect. 10, e0076321 (2022).

Artikel Google Scholar

Corman, VM et al. Vergleich von sieben kommerziellen SARS-CoV-2-Point-of-Care-Antigen-Schnelltests: Eine Laborbewertungsstudie an einem einzigen Zentrum. Lancet Microbe 2, e311–e319 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prince-Guerra, JL et al. Evaluierung des Abbott BinaxNOW-Antigen-Schnelltests für SARS-CoV-2-Infektionen an zwei gemeindenahen Teststandorten – Pima County, Arizona, 3.–17. November 2020. MMWR Morb. Sterblich. Wkly. Rep. 70, 100–105 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pray, IW et al. Durchführung eines antigenbasierten Tests für asymptomatische und symptomatische SARS-CoV-2-Tests an zwei Universitätsgeländen – Wisconsin, September–Oktober 2020. MMWR Morb. Sterblich. Wkly. Rep. 69, 1642–1647 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mistry, DA, Wang, JY, Moeser, ME, Starkey, T. & Lee, LYW Eine systematische Überprüfung der Empfindlichkeit und Spezifität von Lateral-Flow-Geräten beim Nachweis von SARS-CoV-2. BMC-Infektion. Dis. 21, 1–14 (2021).

Artikel Google Scholar

Lee, J., Song, JU & Shim, SR Vergleich der diagnostischen Genauigkeit von Antigen-Schnelltests mit der Echtzeit-Polymerasekettenreaktion bei der Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion: Eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. J. Clin. Virol. 144, 104985 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brümmer, LE et al. Genauigkeit der neuartigen Antigen-Schnelldiagnostik für SARS-CoV-2: Eine lebendige systematische Überprüfung und Metaanalyse. PLoS Med. 18, e1003735 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Simmons, S. & Saguil, A. Schnelle Point-of-Care-Antigen- und Molekulartests zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. Bin. Fam. Arzt 104, 29–30 (2021).

PubMed Google Scholar

Alfaro-Núñez, A. et al. SARS-CoV-2-RNA-Stabilität in Trockentupfern für längere Lagerung und Transport bei unterschiedlichen Temperaturen. Grenzüberschreitend. Emerg. Dis. 69, 189–194 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Perchetti, GA, Huang, M.-L., Peddu, V., Jerome, KR & Greninger, AL Stabilität von SARS-CoV-2 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung für den molekularen Nachweis. J. Clin. Mikrobiol. 58, e01094-e1120 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skalina, KA et al. Eine längere Lagerung von SARS-CoV-2-Nasen-Rachen-Abstrichen hat keinen negativen Einfluss auf die Ergebnisse molekularer Tests auf drei klinischen Plattformen. J. Clin. Pathol. 75, 61–64 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Druce, J., Garcia, K., Tran, T., Papadakis, G. & Birch, C. Bewertung von Abstrichtupfern, Transportmedien und Probentransportbedingungen für einen optimalen Nachweis von Viren durch PCR. J. Clin. Mikrobiol. 50, 1064–1065 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rogers, AA et al. Bewertung von Transportmedien und Probentransportbedingungen zum Nachweis von SARS-CoV-2 mittels real-time reverser Transkriptions-PCR. J. Clin. Mikrobiol. 58, e00708-e720 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karthikeyan, S. et al. Abwassersequenzierung zeigt frühe kryptische Übertragung der SARS-CoV-2-Variante. Natur 609, 101–108 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Coil, DA et al. SARS-CoV-2-Nachweis und Genomsequenzierung aus Krankenhausoberflächenproben, die an der UC Davis gesammelt wurden. PLoS ONE 16, e0253578 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Summer, S. et al. Der Nachweis von SARS-CoV-2 mittels Echtzeit-PCR unter anspruchsvollen präanalytischen Bedingungen zeigt die Unabhängigkeit von Abstrichmedien und Kühlkette. Wissenschaft. Rep. 11, 1–9 (2021).

Artikel ADS Google Scholar

Mann, HB & Whitney, DR Bei einem Test, ob eine von zwei Zufallsvariablen stochastisch größer als die andere ist. Ann. Mathematik. Stat. 18, 50–60 (1947).

Artikel MathSciNet MATH Google Scholar

Van Rossum, G. & Drake, FL Python-Tutorial. Python Software Foundation, Bd. 620 (Zentrum für Mathematik und Informatik Amsterdam, 2012).

R-Kernteam. R: Eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen. https://www.r-project.org/ (2021).

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Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss der Rockefeller Foundation an die University of Florida und die University of Central Florida finanziert, um die regionale Genomüberwachung zu beschleunigen. Die Ansichten und Erkenntnisse sind die der Autoren und nicht die des Geldgebers (der Rockefeller Foundation).

Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, Orlando, FL, USA

Alexa Trujillo, Sobur Ali, Eleonora Cella, Catherine Johnston und Taj Azarian

Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, 02142, USA

Katherine C. DeRuff und Pardis C. Sabeti

Cluster für Genomik und Bioinformatik, University of Central Florida, Orlando, FL, 32816-2993, USA

Taj Azarian

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TA, PCS und KCD haben die Studie konzipiert. Die Labormethodik wurde von AT, SA, KCD, TA durchgeführt und geplant. Untersuchungen und bioinformatische Analysen wurden von SAH, AT, SA, EC, CJ durchgeführt. Visualisierungen wurden von SAH, AT und EC erstellt. Die Studienüberwachung wurde von TA und PCS durchgeführt. Schreiben von Der ursprüngliche Entwurf wurde von SAH, AT, SA, EC und TA durchgeführt. Die Manuskriptprüfung und die Bearbeitungen wurden von SAH, SA, EC, KCD, PCS und TA durchgeführt

Korrespondenz mit Taj Azarian.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hassouneh, S.AD., Trujillo, A., Ali, S. et al. Antigen-Testabstriche sind zur Sequenzierung von SARS-CoV-2 vergleichbar mit Nasopharyngealabstrichen. Sci Rep 13, 11255 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37893-5

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Eingegangen: 16. Juli 2022

Angenommen: 29. Juni 2023

Veröffentlicht: 12. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37893-5

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