Screening auf chitinabbauende Bakterien in der Umwelt Saudi-Arabiens und Charakterisierung der wirksamsten Chitinase aus Streptomyces variabilis Am1

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11723 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei einem Screening auf chitinolytische Bakterien in der Umgebung Saudi-Arabiens wurden 46 vielversprechende chitinolytische Isolate gewonnen. Die drei besten Isolate gehörten zur Gattung Streptomyces. Streptomyces variabilis Am1 war in der Lage, die höchste Menge an Chitinasen auszuscheiden und erreichte das Maximum nach 84 Stunden mit 0,5 % Hefeextrakt und Stickstoffquelle und 2 % Galactose als Kohlenstoffquelle. Die Reinigung der Chitinase durch DEAE-Cellulose und Sephadex G75 verbesserte die spezifische Aktivität auf das 18,6-fache und die Ausbeute auf 23,8 % und zeigte eine Masse von 56 kDa. Die optimale Katalyse der gereinigten Chitinase erfolgte bei 40 °C und pH 8 mit hoher Thermostabilität und pH-Stabilität, was sich in einem mittleren Temperaturwert von 66,6 °C und einer Stabilität bei pH 4–9 widerspiegelt. Die Proteinreagenzien SDS, EDTA und EGTA hemmten das Enzym erheblich und die EDTA-chelatisierte Chitinase stellte ihre Aktivität nach der Zugabe von Fe2+-Ionen wieder her, was auf einen Metallo-Chitinase-Typ mit Eisenionen als Cofaktoren schließen lässt. Chitinase übte eine hohe antimykotische Aktivität gegen einige phytopathogene Pilze aus. Interessanterweise waren die getesteten Streptomyces in der Lage, zusammen mit Chitosan durch Chitinabbau Chitosan-Nanowürfel zu produzieren, was möglicherweise eine zusätzliche Stärke ihrer antimykotischen Aktivität in der Natur darstellt. Diese Arbeit zeigt auch die Bedeutung unerforschter Umgebungen als Pool vielversprechender Mikroorganismen mit biotechnologischen Anwendungen.

Eines der reichhaltigsten Biopolymere der Welt ist Chitin. Es besteht aus N-Acetyl-D-Glucosaminen (NAG), die durch β-1,4-glykosidische Bindungen verbunden sind. Es unterstützt die äußere Schutzschicht vieler Organismen, darunter Insekten, Pilze und andere Krebstiere1. Darüber hinaus bestehen Eierschalen von Nematoden wie Globodera rostochiensis und Meloidogyne javanica zu 9 bzw. 30 % aus Chitin2. Chitin schützt diese pathogenen, parasitären und krankheitserregenden Organismen vor extremen Umweltbedingungen und den Abwehrmechanismen des Wirts und erleichtert so den Parasitismus und die Ausbreitung dieser Organismen auf andere Wirte und andere Orte. Was phytopathogene Pilze betrifft, könnten die Ernteverluste in entwickelten Ländern bis zu 5–25 % betragen, während in unterentwickelten Ländern die Ernteverluste 20–50 % erreichen können3.

Chitinasen sind Enzyme, die Chitin abbauen, indem sie β-1,4-glykosidische Bindungen hydrolysieren und es in Chitooligosaccharid (COS) umwandeln. Die weitere Wirkung von Chitobiasen führt zu NAG. Abhängig von ihrer Aktivität können Chitinasen in die Untergruppen Exochitinasen und Endochitinasen eingeteilt werden4. Im Allgemeinen haben Chitinasen eine Molekülmasse von 20–120 kDa5. Sie gehören zu den Glycosidhydrolasegruppen (GH) GH18 und GH19. Es wurde beobachtet, dass Säugetiere, Pilze und Bakterien Chitinasen der GH18-Familie aufnehmen. Während einige Bakterien und höhere Pflanzen Chitinasen der GH19-Familie enthalten6.

Interessanterweise werden Chitinasen von allen Arthropoden, einschließlich pathogener und nicht pathogener Arten, produziert, um eine wichtige Rolle bei der Ecdysis oder dem Häutungsprozess der aktuellen Kutikula zu spielen und bei der Produktion neuer Kutikula zu helfen. Darüber hinaus sind sie in den Speicheldrüsen mehrerer Insekten vorhanden und werden beim Abbau der Wirtskutikula verwendet7. Außerdem können mehrere Pilze Chitinasen produzieren, die für ihre Ernährung, Morphogenese, Entwicklung und als Abwehrmechanismus gegen andere chitinhaltige Organismen genutzt werden. Zu diesen Arten gehören Saccharomyces cerevisiae und einige filamentöse Pilze wie Trichoderma sp., Penicillium sp., Lecanicillium sp., Aspergillus sp., Stachybotrys sp. und Agaricus sp. Darüber hinaus produzieren einige Nematoden wie Caenorhabditis elegans Chitinase als eine Form der Verteidigung gegen konkurrierende Arten in der Umgebung2.

Chemische Insektizide, Fungizide und Nematizide sind die wichtigsten Instrumente zur Bekämpfung dieser Krankheitserreger. Aufgrund ihrer schädlichen Auswirkungen auf Tiere und Menschen sowie auf die Umwelt werden jedoch neue Techniken eingeführt. Eine der wichtigsten Strategien besteht darin, diese Krankheitserreger mit Chitinasen zu bekämpfen, die von Bakterien wie Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Serratia und Streptomyces produziert werden8.

Die Gattung Streptomyces ist ein häufiger Produzent mehrerer hydrolytischer Enzyme, einschließlich Chitinasen. Chitinasen wurden erfolgreich aus Streptomyces venezuelae9, Streptomyces halstedii10, Streptomyces viridificans11, Streptomyces aureofaciens12, Streptomyces sp. hergestellt. ANU627713, Streptomyces sp. M-2014, Streptomyces sp. DA1115 und Streptomyces sp. S-8416. Was Streptomyces mutabilis betrifft, wurden zuvor nur zwei Stämme vorläufig auf Chitinase-Produktivität zusammen mit anderen Metaboliten untersucht, während mehrere Aktinobakterien-Isolate aus der algerischen Sahara17 und endophytische Aktinobakterien aus den einheimischen Pflanzenwurzeln in Frankreich18 untersucht wurden. Darüber hinaus wurde das Enzym Chitinase in Streptomyces mutabilis noch nie vollständig charakterisiert.

Die Produktion von Chitinasen aus diesen Mikroorganismen wird nicht nur zur biologischen Bekämpfung von Schädlingen eingesetzt, sondern auch für verschiedene Zwecke genutzt, darunter biomedizinische, industrielle und Umweltanwendungen. Darüber hinaus unterstützen sie Kosmetika und verbessern den Geschmack. Beispielsweise werden chitinhaltige Abfälle aus der Lebensmittelindustrie wie Garnelen- und Krabbenschalen mithilfe von Chitinasen abgebaut, um hochwertige Lebens- und Futtermittel wie COS19 herzustellen.

Als Biokontrollmittel gegen phytopathogene Pilze hemmten Chitinasen erfolgreich viele krankheitsverursachende Pilze wie Pestalotia theae, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea und Bipolaris oryzae und zeigten dadurch antimikrobielle Aktivität20,21. Die aktuelle Studie befasst sich mit der grünen Produktion von Chitinase aus bakteriellen Quellen wie Streptomyces variabilis als potenzielles Mittel gegen pflanzenbedrohende phytopathogene Pilze. Nach unseren Informationen ist dies die erste Forschung zur Enzymcharakterisierung der Chitinase aus Streptomyces variabilis.

Bei einem Screening auf chitinolytische Mikroorganismen in der terrestrischen Umwelt Saudi-Arabiens haben wir mehr als 46 vielversprechende Isolate erhalten. Die chitinolytische Aktivität auf Chitin-Agar wurde bei 21,2 % der Isolate bestätigt. Die höchste Anzahl chitinolytischer Isolate (15 %) wurde für Proben aus der Rhizosphärenregion natürlicher Pflanzen verzeichnet, die in der Nafud-Wüste in Saudi-Arabien wachsen. Die drei besten Isolate Nof21, Am1 und Bat2 wurden aus der Wurzelregion von Wildpflanzen gewonnen, die in der Großen Nafud-Wüste, der Dahna-Wüste und der Nord-Shaqra-Wüste in Saudi-Arabien wachsen. Die Sammlung von Bodenproben erfolgte von September bis Dezember 2021.

Die getesteten Streptomyces-Arten waren in der Lage, durch Chitinabbau Chitosan und Chitosan-Nanowürfel (NCs) zu produzieren (Abb. 1a – e). Interessanterweise traten bei der Beurteilung der enzymatischen Produktivität der positiven Isolate zusammen mit der Fermentationsbrühe charakteristische Kügelchen (Abb. 1 oben links) auf. Diese Perlen wurden mittels REM untersucht, was die Bildung von Chitosan und die Bildung von Chitosan-Nanokristallen mit Chitosan im Fall von Bat2 und Am1 zeigte (Abb. 1c). Die Chitosan-NCs des Isolats Am1 waren durch markante Einstülpungen in ihren Zentren gekennzeichnet. Im Hinblick auf die Chitinase-Produktivität wurde das als Nof21 bezeichnete Isolat für den Abschluss der aktuellen Studie ausgewählt.

Charakteristische Perlen, die nach 6 Tagen Fermentation in der Fermentationsbrühe beobachtet wurden (oben links in den Tafeln a, b und c). Die Untersuchung der Perlen mittels SEM ergab die Bildung von Chitosan (weiße Pfeilspitze) und Chitosan-Nanowürfeln (rote Pfeilspitze), insbesondere im Fall der Stämme Bat2 und Stamm Am1. Tafel (d) stellt die Lockerung und den Abbau von Chitin im Verlauf des Chitinabbaus durch das Isolat Am1 dar, während Tafel (e) Chitin vor der enzymatischen Hydrolyse darstellt.

In Bezug auf die Chitinaseproduktion wurden die wirksamsten Isolate (Abb. 2a) molekular auf der Grundlage des 16SrDNA-Genfingerabdrucks als Streptomyces mutabilis Nof21 (Zugangsnummer: OP647097), Streptomyces variabilis Am1 (Zugangsnummer: OP647095) und Streptomyces roietensis Bat2 (Zugangsnummer: OP647097) charakterisiert. OP647096).

(a) Chitinolytische Aktivität einiger lokaler Isolate, die zu Actinomyceten gehören, auf Chitin-Agar, bestehend aus kolloidalem Chitin (10,0 g/l), NH4Cl (5 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l). ), K2HPO4 (0,6 g/l) und bakteriologischer Agar (15 g/l). Das Medium wurde auf pH 7,0 eingestellt und die Kulturen wurden bis zu 6 Tage bei 30 °C inkubiert. Klare Zonen weisen auf die Produktion von Chitinase und die Hydrolyse von Chitin hin. (b) Zeitlicher Verlauf der Enzymproduktion. (c) Bestimmung der Chitinase in Chitin-Agar-Petrischale mit Agar (1,5 %, w/v) und kolloidalem Chitin (1 %, w/v) bei pH 7,0 (b). In jede Vertiefung (7 mm Durchmesser) wurden 40 Mikroliter Chitinase aufgetragen. Am Ende der Inkubationszeit wurde zur Visualisierung der enzymatischen Reaktion 10 Minuten lang eine dünne Schicht Lugol-Jodlösung auf die Oberfläche der Petrischale aufgetragen. Einfache Zucker, die durch den Abbau von Chitin entstehen, absorbieren die Jodlösung nicht, während nicht abgebautes Chitin den Farbstoff absorbiert und rot erscheint.

Das Enzym wurde unter Verwendung des in „Materialien und Methoden“ beschriebenen Basismediums bei pH 6 und 35 °C für bis zu 6 Tage produziert. Abbildung 2b zeigt den Einfluss der Zeit auf die Enzymproduktion durch Streptomyces variabilis Am1. Die Enzymproduktion steigerte sich mit der Zeit während der logarithmischen Phase des Bakterienwachstums und erreichte den höchsten Wert nach 84 Stunden (110,2 U/ml). Das beste Bakterienwachstum wurde am 5. Tag der Inkubation erreicht (24 mg Trockengewicht/1 ml Brühe).

Der Einfluss von Kohlenstoffquellen wie Cellulose, Lactose, Glucose, Galactose, Fructose, Maltose, Mannitol, Saccharose und löslicher Stärke wurde bei einer Konzentration von 2 % (w/v) untersucht. Abbildung 3a zeigt, dass die beste Chitinaseproduktivität bei Streptomyces variabilis Am1 durch Galactose erreicht wurde, wo die Enzymproduktivität 3,1-fach höher war als im Blindtest. Andererseits haben sowohl Saccharose als auch Mannitol die Chitinase-Produktivität im Vergleich zur Kontrollbehandlung verringert.

Einfluss der Kohlenstoffquelle (a) und der Stickstoffquelle (b) auf die Chitinaseproduktion. Das anfängliche Fermentationsmedium bestand aus kolloidalem Chitin (10 g/l), (NH4)2SO4 (5 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l), K2HPO4 (0,6 g/l). l), NaCl (0,6 g/l), FeSO4.7H2O (0,001 g/l), ZnSO4. 7H2O (0,0001 g/l) und MnSO4. 7H2O (0,0001 g/l). Während des Stickstoffquellenexperimentes wurde (NH4)2SO4 durch das getestete Material ersetzt. Das Basismedium wurde auf pH 6,0 eingestellt und die Fermentation erfolgte 6 Tage lang bei 35 °C im Tauchmodus mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 U/min.

Der Einfluss von organischem Stickstoff wie Kasein, Gelatine, Sojamehl, Trypton, Hefeextrakt und Pepton sowie anorganischen Stoffen wie Ammoniumacetat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und NaNO3 auf die Chitinasesekretion wurde getestet 0,5 % (w/v) Konzentration (Abb. 3b). Die maximale Chitinase-Produktivität wurde durch Hefeextrakt mit einer 3,3-fachen Steigerung gegenüber der Kontrolle erreicht. Keines der Mittel Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Natriumnitrat konnte die Chitinaseproduktivität des getesteten Stamms steigern (Abb. 3b).

Die Optimierung der Enzymproduktivität durch das wirksamste Isolat Streptomyces variabilis Am1 wurde durchgeführt, um mit der Enzymreinigung fortzufahren. Die Chitinase wurde durch Anionenaustauschchromatographie (Abb. 4a) bzw. Gelpermeationschromatographie (Abb. 4b) bis zur Homogenität verfeinert, nachdem sie mit 80 % Ammoniumsulfat ausgefällt wurde. Die Enzymrückgewinnung erreichte 23,8 % und die spezifische Aktivität erreichte das 18,6-fache (Tabelle 1). SDS-PAGE zeigte eine Bande mit einer Molekülmasse von etwa 56 kDa (Abb. 4c, Spur 1). Die Zymogrammanalyse (Abb. 4c, Spur 2) des Kulturüberstands zeigte ebenfalls eine Bande enzymatischer Aktivität.

Chromatogramm der von Streptomyces variabilis Am1 produzierten Chitinase auf einer DEAE-Cellulosesäule (2 × 30 cm2) (a). Die gepoolten aktiven Fraktionen aus der DEAE-Cellulose-Säule wurden mit einer Sephadex G75 FF-Säule (2,0 × 45 cm2) weiter gereinigt (b). Die Linie -■- stellt die Chitinaseaktivität dar, während die Linie -○- die Proteinmenge in Bezug auf die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm darstellt. Das zuletzt gewonnene Protein wurde einer SDS-PAGE (c) mit 5 % (Gew./Vol.) Stapelgel und 15 % (Gew./Vol.) Trenngel unterzogen. M stellt die Standardproteine dar, Spur 1 stellt das gereinigte Enzym auf dem SDS-PAGE-Gel dar, während Spur 2 die Aktivitätsgelelektrophorese (Zymogramm) darstellt. Das native Gel enthielt 1,0 % kolloidales Chitin als Substrat, das Gel wurde 16 Stunden lang bei 40 °C in 0,2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, eingetaucht. Die Chitinaseaktivität im nativen Gel wurde durch 15-minütiges Färben mit Lugols Jodlösung und 5-minütiges Entfärben mit 1 N NaCl-Lösung bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Gel in voller Länge ist in der Zusatzinformationsdatei enthalten (Abb. S1).

Der optimale pH-Wert für Chitinase lag bei 8,0 und Chitinase war 60 Minuten lang bei 35 °C bei pH 4–9 stabil (Abb. 5a). Die beste Temperatur für Chitinase lag bei 40 °C (Abb. 5b) und das Enzym war 30 Minuten lang bei 60 °C stabil (Abb. 5c). Es schien, dass die Chitinase durch 15-minütige Vorinkubation bei 50 °C nicht verändert wurde. Aus dem thermischen Inaktivierungsprofil (Abb. 5c) geht hervor, dass der Tm-Wert der Chitinase bei 66,61 °C unter Verwendung von 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) lag (Abb. 5d).

Der Einfluss des pH-Werts auf die Enzymaktivität (-●-) wurde durch Einstellen der Reaktionsmischungen auf unterschiedliche pH-Werte (a) erreicht. Während die pH-Stabilität (-○-) durch Vorinkubation des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten untersucht wurde, wurde anschließend die Restaktivität gegen kolloidales Chitin bestimmt (a). Der Einfluss der Temperatur auf die Chitinaseaktivität (b) wurde durch Inkubation der Reaktionsmischungen bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Während die thermische Stabilität (c) bestimmt wurde, indem Chitinase 15–60 Minuten lang einer Temperatur von 50–80 °C ausgesetzt wurde, wurde anschließend die Restaktivität gegenüber kolloidalem Chitin untersucht. Die Mittelpunktstemperatur (Tm), bei der die getestete Chitinase die Hälfte ihrer Aktivität verlor, wurde aus (d) berechnet.

Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen die Wirkung von Metallionen wie Mg2+, Cu2+, Ca2+, Mn2+, Hg2+, Ag+, Fe2+ und Fe3+ zusätzlich zu β-Mercaptoethanol, SDS, EGTA und EDTA auf die Chitinaseaktivität bei einer Konzentration von 5 mM. Bei allen Behandlungen wurde zu Vergleichszwecken ein Universalrohling erstellt. Das Enzym wurde durch Cu2+- und Mn2+-Ionen leicht gehemmt, während es durch Fe2+-Ionen stimuliert wurde. Die Proteinreagenzien SDS, EDTA und EGTA hemmten die getestete Chitinase signifikant. Interessanterweise stellte das EDTA-chelatisierte Enzym seine Aktivität nach Zugabe von Fe2+-Ionen in einer Konzentration von 5 mM wieder her.

Nach 7-tägiger Inkubation von Eurotium amstelodami, Fusarium oxysporum und Fusarium verticillioides auf PDA-Platten, wobei jede Vertiefung mit 40 µl des Enzympräparats mit 15 U Chitinase beladen war, wurde das antimykotische Potenzial der getesteten Chitinasen in Millimetern (mm) unter Verwendung von a berechnet Digitales Kaliber und Berechnung der Zonen ohne Pilzbewuchs um das Loch herum. Die beste antimykotische Aktivität (Abb. 6) wurde für Chitinase aus Streptomyces variabilis Am1 berichtet, wo sie gute Hemmergebnisse gegen alle getesteten Pilze erzielte; Eurotium amstelodami (14,28 mm), Fusarium verticillioides (22,40 mm) und Fusarium oxysporum (16,18 mm). Die Chitinasen von Streptomyces mutabilis Nof21 und Streptomyces roietensis Bat2 hemmten nur den pflanzenpathogenen Pilz Fusarium verticillioides (14,20 bzw. 14,98 mm). Die hitzeinaktivierte Chitinase zeigte keine Aktivität gegen einen der getesteten phytopathogenen Pilze.

Die antimykotische Aktivität von drei Chitinasen, die von lokalen Streptomyces spp. (Am1, Bat2 und Nof21) produziert werden, gegen Eurotium amstelodami (a), Fusarium verticillioides (b) und Fusarium oxysporum (c). In jede Vertiefung wurden genau 40 µl (15 U) Enzympräparate aufgetragen. Als Negativkontrolle wurde ein hitzeinaktives Enzympräparat verwendet. Bis zur 7-tägigen Inkubation bei 30 °C wurde in regelmäßigen Abständen Pilzwachstum beobachtet.

Chitinasen sind sehr nützlich beim Abbau von Chitinabfällen und bei der biologischen Bekämpfung chitinhaltiger Krankheitserreger wie Pilze, Insekten und Nematoden. Daher wurde ein Screening auf chitinolytische Bakterien in der terrestrischen Umgebung Saudi-Arabiens durchgeführt. Wir haben mehr als 46 vielversprechende Isolate erhalten. Die wirksamsten Isolate wurden anhand des 16SrDNA-Genfingerabdrucks als Streptomyces mutabilis, Streptomyces variabilis und Streptomyces roietensis charakterisiert. In früheren Studien diskutierten nur sehr wenige Autoren die Fähigkeit dieser Arten, Chitinasen zu produzieren. Die Fähigkeit von Streptomyces variabilis, Chitinase zu produzieren, wurde nur bei zwei Stämmen nachgewiesen; Stamm LCP1822 und Stamm YH2123. Unseres Wissens wurde nie über die Produktion von Chitinase aus Streptomyces mutabilis und Streptomyces roietensis berichtet.

Im Hinblick auf die Enzymproduktivität wurde Streptomyces variabilis für den Abschluss dieser Studie ausgewählt. Die Enzymproduktion steigerte sich mit der Zeit während der logarithmischen Phase des Bakterienwachstums und erreichte den höchsten Wert nach 84 Stunden (110,2 U/ml). Das beste Bakterienwachstum wurde am 5. Tag der Inkubation erreicht (24 mg Trockengewicht/1 ml Brühe). Die beste Fermentation erfolgte bei Streptomyces venezuelae P10 bei 30 °C nach 96 Stunden, während Streptomyces sp. ANU6277 produzierte den maximalen Chitinasespiegel bei 35 °C nach 60 Stunden Fermentation13.

Die beste Produktivität von Streptomyces variabilis Am1 wurde in Gegenwart von Galactose als Kohlenstoffquelle erreicht (3,1-fach höher als im Blindtest). Anderen Forschern zufolge war die Chitinaseproduktion im Fall von Streptomyces halstedii in Gegenwart von Glucose10, Arabinose im Fall von Streptomyces viridificans11 und Stärke im Fall von Streptomyces sp. hochwirksam. ANU627713 und Streptomyces aureofaciens12.

Die maximale Chitinase-Produktivität wurde durch Hefeextrakt mit einer 3,3-fachen Steigerung gegenüber der Kontrolle erreicht. Keines der Mittel Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Natriumnitrat konnte die Chitinase-Produktivität des getesteten Stamms steigern. Hefeextrakt war auch die optimale N-Versorgung für die Chitinase-Produktivität aus Streptomyces sp. ANU627713.

Als Chitinase durch Anionenaustauschchromatographie und Gelpermeationschromatographie zur Homogenität verfeinert wurde, zeigte sie durch SDS-PAGE (Abb. 4c, Spur 1) und aktivitätszymographische Gelelektrophorese (Abb. 4c, Spur 2) eine Molekülmasse von etwa 56 kDa. Im Allgemeinen haben von Mikroorganismen produzierte Chitinasen eine Molekularmasse im Bereich von 20 bis 120 kDa. Pilzchitinasen haben ein Gewicht von 35 bis 45 kDa24, während die meisten bakteriellen Chitinasen meist etwa 20–60 kDa25 wiegen. Chitinasen von Streptomyces wiegen 20 kDa für Streptomyces sp. M-20 (Kim et al. 2003)14, 28 kDa, 35 kDa und 45 kDa für Streptomyces sp. NK 1057 (Nawani und Kapadnis 2004)26, 34 kDa für Streptomyces sp. DA11 (Han et al. 2009)15, 43 kDa und 45 kDa für S. albovinaceus S-2227, 45 kDa für Streptomyces sp. ANU627713 und 49 kDa für S. griseus HUT 603728 und 66 kDa für Streptomyces venezuelae P109.

Der optimale pH-Wert für Chitinase lag bei 8,0 und Chitinase war 60 Minuten lang bei 35 °C bei pH 4–9 stabil (Abb. 5a). Die beste Temperatur für Chitinase lag bei 40 °C (Abb. 5b) und das Enzym war 30 Minuten lang bei 60 °C stabil (Abb. 5c). Zuvor wurde festgestellt, dass die optimale Reaktionstemperatur für Chitinasen aus Streptomyces insbesondere bei 40 °C29 und im Allgemeinen im Bereich von 30–55 °C30 liegt. Streptomyces sp. M-20-Chitinase übte ihre maximale Aktivität bei 30 °C und pH 5,0 aus, außerdem war sie bei pH 4,0–8,0 stabil und thermisch stabil bis 40 °C14. Streptomyces venezuelae P10-Chitinase war bei 35 °C und einem pH-Wert von 6–89 maximal aktiv. Während die Chitinase von Streptomyces sp. DA11 war bei 50 °C und einem pH-Wert von 815 maximal aktiv.

Wir schlagen einen Metalloenzymtyp mit Eisenionen als Cofaktoren vor, da die EDTA-chelatisierte Chitinase ihre Aktivität nach Zugabe von Fe2+-Ionen wiederherstellte. Wir empfehlen keine Chitinase mit Thiolgruppen, da es bei der Behandlung mit β-Mercaptoethanol und Hg2+-Ionen zu keiner Erhöhung der Aktivität kam. Die Hemmung der Chitinase durch SDS wurde auch von Groleau et al.31 berichtet. Die Hemmung von Enzymen durch die Chelatbildner EGTA und EDTA wurde auch von Streptomyces sp. berichtet. DA11-Chitinase15 und war bei Streptomyces sp. unterschiedlich. M-20-Chitinase14 und Streptomyces sp. S-84-Chitinase16.

Streptomyces variabilis Am1-Chitinase zeigte gute Hemmergebnisse gegen alle getesteten Pilze; Eurotium amstelodami, Fusarium verticillioides und Fusarium oxysporum. Die Abhängigkeit von der hydrolytischen Aktivität mikrobieller chitinolytischer Enzyme bei der Biokontrolle schädlicher Pilze, insbesondere des phytopathogenen Typs, ist in vielen Studien gut belegt. Es wurde festgestellt, dass chitinolytische Enzyme aus Actinobakterien, insbesondere der Gattung Streptomyces, verschiedene Mechanismen der antimykotischen Aktivität aufweisen, wie z. B. die Hemmung der Keimung von Pilzsporen, die Hemmung der Keimrohrverlängerung und die Induktion des Platzens von Sporen und Hyphenspitzen12,32. Die Anwendung von bakteriellen Chitinasen in antimykotischen Anwendungen wurde erstmals aus Streptomyces griseus HUT 603733 berichtet. Es wurde festgestellt, dass Streptomyces venezuelae P10-Chitinase Aspergillus niger maximal hemmt, Penicillium chrysogenum jedoch nicht hemmt9. Streptomyces sp. DA11-Chitinase wurde zur Biokontrolle von Aspergillus niger (11,0 mm) und Candida albicans (10,5 mm)15 eingesetzt. Hoster et al.29 fanden Chitinaseaktivität eines Streptomyces-Stammes gegen Fusarium culmorum, Aspergillus nidulans, Gulgnardia bidwellii, Botrytis cinerea und Sclerotia sclerotiorum. Narayana und Vijayalakshmi13 berichteten über die chitinolytische Aktivität von Streptomyces sp. ANU6277 gegen Fusarium udum. Kim et al.14 zeigten die Hemmung des Phytopathogens Botrytis cinerea durch Chitinase aus Streptomyces sp. M-20.

Die Fähigkeit getesteter Streptomyces-Arten, durch Chitinabbau Chitosan und Chitosan-NCs zu produzieren (Abb. 1a – e), könnte neben der Hydrolyseaktivität von Chitinase ein zusätzliches Hilfsmittel für ihre antimykotische Aktivität sein. Anderen Forschern zufolge wurde Chitosan aufgrund seiner polykationischen Natur, die die Adsorption an negativ geladene Zellbestandteile auf der Oberfläche pathogener Mikroorganismen erleichtert, von vielen Forschern als antibakterielles und antimykotisches Mittel eingesetzt34.

Der weitere Abbau von Chitosan zu Chitosan-Nanopartikeln (NPs) und NCs erhöht sein antimykotisches Potenzial aufgrund einer verbesserten Oberfläche und Verkapselungsleistung35. Darüber hinaus erzeugt die Einwirkung von Metallnanopartikeln auf Mikroben, einschließlich Pilze, oxidativen Stress in Form reaktiver Sauerstoffspezies, die die selektive Permeabilität der Zellen stören und Nukleinsäuren sowie die Proteinsynthese hemmen.

Chitosan-NPs und -NCs wurden mit chemischen und physikalischen Methoden hergestellt und von Agrarforschern als Antimykotika eingesetzt, um den Einsatz chemischer Fungizide zu ersetzen. Beispielsweise haben Chouhan et al.36 die Fusarium-Fäule von Weizen durch chemisch hergestellte Chitosan-NPs bekämpft. Biologisch hergestellte NPs und NCs sind umweltfreundlich, biokompatibel, haben eine bessere Permeabilität in die Zelle, eine geringere Toxizität und sind kostengünstiger37. Anderen Forschern zufolge wurde ein Konjugat aus Chitosan-NPs und Silber-NPs als antimykotische Zusammensetzung gegen Fusarium-Arten verwendet. Leider war es teuer und für den Feldeinsatz in der Landwirtschaft ungeeignet38. Der Wert dieser Forschung besteht darin, dass es das erste Mal ist, dass Chitosan-NPs und -NCs unter Verwendung von Streptomyces hergestellt werden. Insbesondere die Nanokristalle weisen eine überlegene Aktivität auf als andere Formen von Nanopartikeln.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 46 chitinolytische Isolate aus der Rhizosphäre einiger Wüstenpflanzen in Saudi-Arabien gewonnen wurden. Die ersten drei wurden aus der Wurzelregion von Wildpflanzen gewonnen, die in der Großen Nafud-Wüste, der Dahna-Wüste und der Nord-Shaqra-Wüste wachsen, und dann als Streptomyces mutabilis Nof21, Streptomyces variabilis Am1 bzw. Streptomyces roietensis Bat2 identifiziert. Nach unserem Kenntnisstand wurde nie über die Produktion von Chitinasen aus Streptomyces mutabilis und Streptomyces roietensis berichtet, außerdem wurde nie eine Charakterisierung der Chitinase aus Streptomyces variabilis durchgeführt. Interessanterweise zeigte die SEM die Bildung von Chitosan-NCs zusammen mit Chitosan durch den Abbau von Chitin. Die Fähigkeit getesteter Streptomyces-Arten, durch Chitinabbau Chitosan und Chitosan-NCs zu produzieren, könnte neben der Hydrolyseaktivität von Chitinase ein zusätzlicher Faktor für ihre antimykotische Aktivität sein. Chitosan selbst ist aufgrund seiner Fähigkeit, die Zellen pathogener Mikroorganismen zu adsorbieren, ein antimikrobieller Wirkstoff. Chitosan-NCs erhöhen das antimykotische Potenzial aufgrund der verbesserten Oberfläche und der Entstehung von oxidativem Stress. Der Wert dieser Forschung besteht darin, dass es das erste Mal ist, dass Chitosan-NCs unter Verwendung von Streptomyces hergestellt werden. Darüber hinaus könnte diese Metallo-Chitinase aufgrund der im Vergleich zu vielen chitinolytischen Enzymen einzigartigen Fähigkeit zum Chitinabbau, der pH-Stabilität und der thermischen Beständigkeit als wirksameres chitinolytisches Mittel angesehen werden, das insbesondere auf phytopathogene Pilze abzielt.

Sephadex G75 FF (schneller Durchfluss) und DEAE-Cellulose wurden von Pharmacia Biotech (Schweden) bezogen. Chitin, β-Mercaptoethanol, SDS, EGTA und EDTA wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen. Zusätzliche Reagenzien waren analytisch und wurden von regionalen Anbietern bezogen.

Abfälle von Garnelenschalen wurden auf dem regionalen Fischmarkt Dammam in Saudi-Arabien gesammelt. Um die Feuchtigkeit zu entfernen, wurden sie dann in der Sonne getrocknet, bis ein konstantes Trockengewicht erreicht war. Anschließend wurden sie zu einem feinen Pulver gemahlen. Chitin wurde aus dem gesamten Garnelenpulver durch den Entmineralisierungsschritt und den Deproteinisierungsschritt extrahiert39. Anschließend wurde kolloidales Chitin durch Zugabe von 5 g des vorherigen Materials zu 88 ml konzentrierter HCl hergestellt und 3 Stunden lang auf einem Magnetrührer gerührt. Unter Rühren für weitere 3 Stunden wurde genau ein Liter gekühltes destilliertes Wasser zugegeben. Die Suspension wurde 24 Stunden lang bei 4 °C im Kühlschrank belassen. Das dichte weiße Pellet wurde durch Büchner-Filtration gesammelt. Die Paste besteht aus kolloidalem Chitin, das in destilliertem Wasser suspendiert wurde und die Filtration wiederholt wird, um HCl und die unerwünschten löslichen Rückstände zu entfernen. Die letzte Paste wird für die nächsten Anwendungen bei 4 °C aufbewahrt.

Es wurden mehrere Bodenproben aus verschiedenen Orten Saudi-Arabiens entnommen. Zunächst wurden 1000 µl aus geeigneten Verdünnungen mit Chitin-Agarplatten bestehend aus kolloidalem Chitin (10,0 g/l), NH4Cl (5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), K2HPO4 (0,6 g/l) und bakteriologischer Agar (15 g/l). Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7,0 korrigiert und die Inkubation erfolgte bis zu 6 Tage bei 35 °C. Aufgelöste Ringe um die Kolonien wurden als erster Hinweis auf eine Chitinhydrolyse gewertet. Chitinolytische Isolate wurden durch quadratisches Ausstreichen gereinigt und Einzelzellkolonien wurden bei –80 °C in 20 % (v/v) sterilisiertem Glycerin konserviert.

Das anfängliche Fermentationsmedium, das zur Bewertung der Chitinase-Produktivität unter den aus Bodenproben gewonnenen Isolaten verwendet wurde, bestand aus kolloidalem Chitin (10,0 g/l), (NH4)2SO4 (5,0 g/l), MgSO4·7H2O (0,5 g/l), KH2PO4 (2,4 g/l), K2HPO4 (0,6 g/l), NaCl (0,6 g/l), FeSO4.7H2O (10,0 mg/l), ZnSO4. 7H2O (1,0 mg/l) und MnSO4. 7H2O (1 mg/l). Das Basalmedium wurde auf pH 6,0 korrigiert und dann 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf unter 45 °C enthielt jeder 250-ml-Erlenmeyerkolben 50 ml Flüssigkeit und wurde mit 2 ml (107 Sporen/ml) einer 7 Tage alten Kultur beimpft. Die Inkubation erfolgte 6 Tage lang bei 35 °C in einem Schüttelinkubator mit einer Geschwindigkeit von 150 U/min. Das mikrobielle Wachstum wurde durch Filtration und anschließende Zentrifugation bei 5000 U/min für 20 Minuten entfernt. Die Enzymproduktion unter den Isolaten wurde bewertet und das wirksamste Isolat wurde ausgewählt. Anschließend wurden die Ernährungs- und Umweltparameter optimiert, um die höchste Chitinase-Produktivität zu erreichen. Die fertige Fermentationsbrühe wurde zur Enzymreinigung verwendet.

Für die Extraktion bakterieller DNA wurde das QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß den Richtlinien des Anbieters eingesetzt. Das für die 16S-rRNA kodierende Gen wurde teilweise durch Verwendung von 10 µM jedes Universalprimers amplifiziert: 27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′) als Vorwärtsprimer und 800R (5′TACCAGGGTATCTAATCC3′) als Rückwärtsprimer. Die PCR wurde dann 10 Minuten lang bei 95 °C gestartet, gefolgt von einem 35-minütigen Denaturierungszyklus bei derselben Temperatur für 1 Minute, dem Annealing-Schritt bei 56 °C für 1,15 Minuten und dem Verlängerungsschritt für 2 Minuten bei 72 °C durch letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 Minuten. Das Reaktionsprodukt wurde in der Agarosegelelektrophorese von 1,5 % Agarose eluiert. Das Gel wurde mit Ethidiumbromidlösung gefärbt und anschließend wurden die Gelbanden unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die PCR-Amplikons wurden von ExoSAP-IT (Applied Biosystems, USA) gereinigt und die gereinigten Amplikons wurden für die Sequenzierung mit dem Big Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) und dem DyeEx-Reinigungskit (Qiagen, Deutschland) vorbereitet. Die Sequenzierung wurde auf einem SeqStudio Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Folglich wurden die erworbenen 16S-rRNA-Teilgensequenzen in der GenBank-Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) hinterlegt, nachdem Arten mit der höchsten Ähnlichkeit mithilfe des National Center for Biotechnology Information (NCBI) durch BLAST-Suchen identifiziert wurden (http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Die Enzym-Substrat-Reaktion wurde durch Mischen von 1 ml 10 % (Gew./Vol.) kolloidaler Chitinsuspension in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 ml Enzympräparat eingeleitet. Die Reaktion lief bei 50 °C ab und wurde dann nach 1 Stunde durch 1 ml 1 % NaOH und 5-minütige Inkubation in einem kochenden Wasserbad (100 °C) beendet. Die Zentrifugation erfolgte 15 Minuten lang bei 5000 U/min, um das Produkt vom nicht reagierenden Substrat abzuspalten. Anschließend wurden die gesamten reduzierenden Zucker mittels Dinitrosalicylsäure (DNS)-Assay gemessen40. Genauer gesagt wurde 1 ml des Überstands mit 1 ml 1 % DNS in 30 % Natriumkaliumtartrat in 2 M NaOH kombiniert. Die Mischung wurde verwirbelt und 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erneut inkubiert. Die Farbverschiebung in Richtung Rot ist ein direkter Hinweis auf das Vorhandensein reduzierender Zucker und daher proportional zur enzymatischen Aktivität. Die Absorption der Testprobe wurde bei A535 (UV5 Excellence UV/VIS Spectrophotometers, Mettler Toledo, Schweiz) gemessen. Eine Einheit (U) Chitinase wurde als die Enzymmenge berechnet, die erforderlich ist, um 1 µmol NAG als reduzierenden Zucker pro Minute bei 50 °C zu erzeugen. Die Proteinquantifizierung erfolgte bei A280 unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standardprotein.

In einigen Experimenten wurde die chitinolytische Aktivität durch Chitin-Agar-Well-Diffusionsplatten sichtbar gemacht, die aus kolloidalem Chitin (10 g/l) und Agar (15 g/l) bei pH 7,0 bestanden. Genau genommen wurden Vertiefungen mit einem Durchmesser von 10 mm mit einem sterilen Korkporer gebündelt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Enzympräparat gegeben. Die Leerprobe erfolgte mit 50 µl eines thermisch inaktivierten Chitinase-Präparats. Die Bildung geklärter Halos wurde nach 24 Stunden bei 35 °C durch 10-minütige Zugabe einer dünnen Schicht Lugolscher Jodlösung auf die Oberfläche der Petrischale überprüft. Einfache Zucker, die beim Abbau von Chitin entstehen, absorbieren die Jodlösung nicht, während nicht abgebautes Chitin den Farbstoff absorbiert und rot erscheint.

Das Verfahren zur Abtrennung der Chitinase aus der Kulturbrühe des wirksamsten Isolats wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min eingeleitet, um die Zellen und Trümmer von den Bakterienprodukten zu trennen. Die im Überstand vorhandenen Proteine und Enzyme wurden dann durch schrittweise Zugabe von Ammoniumsulfat unter häufigem Rühren ausgefällt, bis ein Sättigungsgrad von 80 % erreicht war. Nach 12-stündiger Inkubation bei 4 °C wurden die agglomerierten Enzymmoleküle durch 10-minütige Zentrifugation bei 7000 g und 4 °C geerntet. Die Ernte wurde dann in 100 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 (Puffer A) zur Dialyse gegen Puffer A suspendiert, um Ammoniumsulfat und andere Salze zu entfernen. Das resultierende Dialysat wurde dann auf die Oberseite einer DEAE-Cellulose-Anionenaustauschersäulenchromatographie mit einer Abmessung von 2,0 × 30 cm2 aufgetragen. Die Elution erfolgte mit 100 mM Boratpuffer pH 9,4 (Puffer B) mit 0–1 M NaCl in einem linearen Gradienten. Die aktiven Fraktionen aus der Anionenaustauschersäule wurden gesammelt und zur weiteren Reinigung mit der Gelpermeationschromatographietechnik lyophilisiert. Hierzu wurde eine Sephadex G75 FF-Säule mit den Abmessungen 2,0 × 45 cm2 verwendet. Die Elution durch diese Säule erfolgte mit Puffer A bei einer Flussrate von 0,5 ml pro Minute. Auch hier wurden die Fraktionen, die die Chitinaseaktivität repräsentieren, zur Charakterisierung und Anwendung kombiniert und lyophilisiert. Letztendlich wurde die SDS-PAGE unter Verwendung von 5 % (Gew./Vol.) Stapelgel und 12 % (Gew./Vol.) Trenngel durchgeführt, um die Reinheit der Chitinase zu überprüfen und die genaue Molekülmasse der getesteten Chitinase zu verifizieren. Für die Zymogrammanalyse wurde die rohe Chitinase mit dem Ladepuffer ohne Reduktionsmittel und Kochschritt gemischt. Nach der Elektrophorese in einem Gel, das 1,0 % kolloidales Chitin als Substrat enthielt, wurde das Gel 16 Stunden lang in 0,2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, bei 40 °C eingetaucht. Die Chitinaseaktivität im nativen Gel wurde durch 15-minütiges Färben mit Lugols Jodlösung und 5-minütiges Entfärben mit 1 N NaCl-Lösung bei Raumtemperatur sichtbar gemacht.

Chitinase-Substrat-Reaktionsmischungen wurden auf verschiedene pH-Werte korrigiert. Der pH-Bereich von 2,0–6,0 wurde durch den Citrat-Phosphat-Puffer erreicht, der pH-Bereich von 7,0–8,0 wurde durch den Tris-HCl-Puffer erreicht und pH-Werte von 9,0–11,0 wurden durch den Glycin-NaOH-Puffer erreicht. Der Test der Chitinaseaktivität wurde bei 35 °C unter Verwendung des Substrats kolloidales Chitin durchgeführt. Darüber hinaus wurde die pH-Stabilität durch 60-minütige Vorinkubation von Chitinase allein bei 35 °C im gleichen pH-Bereich beurteilt, anschließend wurde die verbleibende Aktivität gegen kolloidales Chitin bei pH 8,0 mit 50 mM Tris-HCl-Puffer beurteilt.

Der Einfluss der Temperatur auf das Enzym wurde bei 20 °C bis 50 °C bewertet. Das kolloidale Chitin-Substrat wurde in einer Konzentration von 1,5 % (Gew./Vol.) verwendet. Das kolloidale Chitin wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer auf pH 8,0 eingestellt. Die Hitzestabilität von Chitinase wurde durch Vorinkubation von Chitinasepräparaten ohne Substrat im gleichen Puffer bei hohen Temperaturen von 50–80 °C für 15–60 Minuten bewertet. In bestimmten Zeitabständen wurde die verbleibende Aktivität bewertet. Die Temperatur, bei der Chitinase nach 60-minütiger Einwirkung die Hälfte ihrer ursprünglichen Aktivität verlor, wurde als Mittelpunkttemperatur (Tm) definiert.

Die gereinigte Chitinase wurde 60 Minuten lang bei 35 °C in Gegenwart eines Metalls wie Mg2+, Cu2+, Ca2+, Mn2+, Hg2+, Ag+, Fe2+ und Fe3+ sowie üblicher Reagenzien wie β-Mercaptoethanol, SDS, EGTA vorinkubiert und EDTA. Sie wurden mit einer Stärke von 5 mM in 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) getestet. Anschließend wurde die verbleibende Aktivität bewertet. Die Aktivität der Chitinase in Abwesenheit von Metallen, Aktivatoren oder Inhibitoren wurde als 100 % angesehen.

Das antimykotische Potenzial der drei gereinigten Chitinasen Am1, Bat2 und Nof21 wurde mit der Methode der Agar-Well-Diffusion gemäß dem National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)41 untersucht. Fünf Tage alte Sporensuspensionen (3 × 107/ml) in einer Konzentration von 1 ml Eurotium amstelodami (Aspergillus amstelodami), Fusarium oxysporum und Fusarium verticillioides wurden gleichmäßig und einzeln auf Platten mit Kartoffel-Dextrose-Agar ausgebreitet, wobei der pH-Wert auf 5,5 eingestellt war. Die Kulturen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen, um die Aufnahme des Inokulums zu ermöglichen. 8-mm-Wells wurden mit einem sterilen Korkbohrer ausgestanzt und 40 µl Chitinase-Präparat auf jedes Well aufgetragen (15 U). Als Negativtest wurde ein hitzeinaktives Enzympräparat verwendet. Das Wachstum von Pilzen wurde in regelmäßigen Abständen 7 Tage lang bei 30 °C beobachtet. Um die Zuverlässigkeit sicherzustellen, wurden die Tests in drei Wiederholungen durchgeführt.

Die Tests wurden dreifach durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten und analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind in der GenBank-Datenbank unter der Zugangsnummer OP647097 für Streptomyces mutabilis Nof21, der Zugangsnummer OP647095 für Streptomyces variabilis Am1 und der Zugangsnummer OP647096 für Streptomyces roietensis Bat2 verfügbar.

Nationales Komitee für klinische Laborstandards

Diethylaminoethylcellulose

Dinitrosalicylsäure

Ethylendiamintetraessigsäure

Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure

N-Acetyl-D-glucoseamin

Kartoffel-Dextrose-Agar

Natriumdodecylsulfat

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Mittelpunkttemperaturwert

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Die Autoren danken Professor Medhat A. ElNaggar vom Agricultural Research Center, Plant Pathology Research Institute, Ägypten, und Research Central Lab., SAGO, Saudi-Arabien, für die Bereitstellung der phytopathogenen Pilze.

Die Autoren danken dem Stellvertreter für Forschung und Innovation des Bildungsministeriums in Saudi-Arabien für die Finanzierung dieser Forschungsarbeit unter der Projektnummer IF-2020-028-BASRC an der Imam Abdulrahman bin Faisal University (IAU)/Zentrum für Grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung ( BASRC).

Basic and Applied Scientific Research Center (BASRC), Imam Abdulrahman Bin Faisal University (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Saudi-Arabien

Essam Kotb, Amira H. Alabdalall, Azzah I. Alghamdi, Ibtisam M. Ababutain, Safa K. Al-Zuwaid, Batool M. Algarudi und Sakina M. Algarudi

Department of Biology, College of Science, Imam Abdulrahman Bin Faisal University (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Saudi-Arabien

Essam Kotb, Amira H. Alabdalall, Azzah I. Alghamdi, Ibtisam M. Ababutain, Safa K. Al-Zuwaid, Batool M. Algarudi und Sakina M. Algarudi

Das National Center for Genomic Technology (NCGT), Life Science and Environment Research Institute, King Abdulaziz City for Science and Technology (KACST), Riad, Saudi-Arabien

Sumayh A. Aldakeel

Genomic of Infectious Diseases Laboratory, Saudi Center for Disease Prevention and Control, Public Health Authority, Riad, Saudi-Arabien

Sumayh A. Aldakeel

Abteilung für Statistik, Fakultät für Handel, Al-Azhar-Universität (Mädchenabteilung), Postfach 11751, Kairo, Ägypten

Asmaa A. Ahmed

Abteilung für Pathologie, Medizinische Fakultät, King Saud University, Riad, Saudi-Arabien

Ahmed M. Albarrag

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EK und AHA führten Enzymtests und -charakterisierungen durch. AIA und IMA bewerteten die antimykotische Aktivität der gewonnenen Chitinasen und die SEM-Studie. SAA und AMA haben die molekulare Charakterisierung von Isolaten durchgeführt. SKA, SMA und BMA sammelten die Bodenproben, isolierten die Mikroorganismen und führten das erste Screening auf Chitinaseaktivität durch. AAA führte die Statistiken, Grafiken und Präsentation der Daten durch. Alle Autoren haben gleichermaßen zum Schreiben, Bearbeiten und Verfassen des Manuskripts beigetragen und die endgültige Form genehmigt.

Korrespondenz mit Essam Kotb.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kotb, E., Alabdalall, AH, Alghamdi, AI et al. Screening auf chitinabbauende Bakterien in der Umwelt Saudi-Arabiens und Charakterisierung der wirksamsten Chitinase aus Streptomyces variabilis Am1. Sci Rep 13, 11723 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38876-2

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Eingegangen: 12. Februar 2023

Angenommen: 16. Juli 2023

Veröffentlicht: 20. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38876-2

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Screening auf chitinabbauende Bakterien in der Umwelt Saudi-Arabiens und Charakterisierung der wirksamsten Chitinase aus Streptomyces variabilis Am1