PP2A

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12720 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Entscheidend für die Aufrechterhaltung der epidermalen Integrität und Funktion sind Verbindungen zwischen Zwischenfilamenten (IF) und interzellulären Verbindungen, den sogenannten Desmosomen. Das desmosomale zytoplasmatische Plaqueprotein Desmoplakin (DP) ist für die Verankerung von IF an der Verbindungsstelle essentiell. DP-IF-Wechselwirkungen werden durch ein phosphoregulierendes Motiv innerhalb des DP-C-Terminus reguliert, das die interzelluläre Adhäsion von Keratinozyten steuert. Hier identifizieren wir das Proteinphosphatase 2A (PP2A)-B55α-Holoenzym als die wichtigste Serin/Threonin-Phosphatase, die den C-Terminus von DP und die daraus resultierende interzelluläre Adhäsion reguliert. Mit einer Kombination aus chemischen und genetischen Ansätzen zeigen wir, dass das PP2A-B55α-Holoenzym mit DP an interzellulären Membranen in 2D- und 3D-Epidermismodellen und menschlichen Hautproben interagiert. Unsere Experimente zeigen, dass PP2A-B55α den Phosphorylierungsstatus von junktionalem DP reguliert und für die Aufrechterhaltung einer starken Desmosomen-vermittelten interzellulären Adhäsion erforderlich ist. Diese Daten identifizieren PP2A-B55α als Teil eines Regulierungsmoduls, das in der Lage ist, die interzelluläre Adhäsionsstärke anzupassen, und als mögliches Krankheitsziel bei Desmosomen-bedingten Erkrankungen der Haut und des Herzens.

Zytoskelett-assoziierte interzelluläre Adhäsionsverbindungen sind für die Aufrechterhaltung der Stabilität mehrzelliger Gewebe und die Bereitstellung der strukturellen Integrität der Zellen für den Widerstand gegen die sich ändernde mechanische Umgebung des Gewebes von wesentlicher Bedeutung. Dies ist besonders wichtig bei Geweben, die einer hohen äußeren oder inneren mechanischen Belastung ausgesetzt sind, wie etwa die geschichtete Epidermis oder das Herz. Besonders wichtig für diese Gewebe sind Desmosomen, interzelluläre Verbindungen, die chemische und mechanische Reize integrieren, um die dynamische Regulierung des kortikalen Zytoskeletts zu ermöglichen1,2.

Das Desmosom umfasst Transmembran-Cadherine aus zwei Familien, Desmogleine (Dsg) und Desmocolline (Dsc), zwei Plaque-Gürteltierproteine, Plakophilin (Pkp) und Plakoglobin (PG), und ein Intermediate-Filament (IF)-Zytoskelett-Linkerprotein, Desmoplakin (DP). Durch die Bindung des IF-Zytoskeletts an die Plasmamembran verstärkt DP die Adhäsion und verteilt Kräfte im gesamten Gewebe1,2. Im Gegensatz zu den Dsg-, Dsc- und Pkp-Familien, die durch die Isoformenexpression in bestimmten differenzierten Schichten der geschichteten Epidermis reguliert werden, ist DP das einzige Plakin-Protein des Desmosoms und wird daher ubiquitär in allen desmosomenbildenden Zellen exprimiert3. Die wesentliche Natur von DP wird am besten durch den embryonalen letalen Phänotyp von DP-Nullmäusen und die schwerwiegenden Defekte hervorgehoben, die in Hochspannungsgeweben, einschließlich Haut und Herz, von tetraploiden Rettungsmäusen und epidermal spezifischen Knockout-Mäusen auftreten4,5,6. Darüber hinaus führen Mutationen im DSP-Gen zu einer Reihe von Erkrankungen, von der letalen akantholytischen Epidermolysis bullosa (LAEB) über die striate palmar plantar Keratodermie (SPPK) bis hin zur arrhythmogenen Kardiomyopathie (AC) und dem kardiokutanen Carvajal-Syndrom7,8,9,10,11 ,12,13.

Bemerkenswert ist, dass DP teilweise durch die prozessive Phosphorylierung einer Glycin-Serin-Arginin-Wiederholung an ihrem C-Terminus direkt stromabwärts der DP-IF-Bindungsstelle reguliert wird (Abb. 1A)14,15. Frühere Arbeiten unserer Gruppe und anderer haben charakterisiert, dass die hypophosphorylierte Form von DP eine erhöhte IF-Bindungsaffinität aufweist, die sich auf die Desmosomenbildung, -dynamik und -funktion auswirkt14,16,17,18. Insbesondere erhöhte die Expression von konstitutiv hypophosphorylierten DP-Mutanten die Adhäsionsstärke und Gewebesteifheit, was dazu führte, dass epidermale Zellschichten höheren mechanischen Belastungen standhalten konnten17,18,19. Es wurde zuvor festgestellt, dass die Phosphorylierung des phosphoregulatorischen Motivs von DP durch die koordinierte Aktivität der Glykogensynthasekinase 3β (GSK3β) und des Proteins Argininmethyltransferase 1 (PRMT-1) ausgelöst wird14. Trotz der Bedeutung der hypophosphorylierten Form von DP für die Stärkung der IF-Bindung blieb die für die Dephosphorylierung von DP verantwortliche Phosphatase unbekannt.

PP2A ist eine Phosphatase für die C-terminale Domäne von DP. (A) Schematische Darstellung der DP-Strukturdomänen und des DP-S-Tag-Konstrukts, das nur die Reste 2628–2871 enthält. Unten ist das 68 Reste lange „GSR“-Repeat-Phosphoregulationsmotiv stromabwärts der IF-Bindungsstelle hervorgehoben, das DP-IF-Wechselwirkungen regulieren kann. (B) Ein 15 %iges Acrylamidgel ohne (links) und mit (rechts) Phos-Tag-Molekül, das in der Lage ist, Protein anhand seiner Anzahl an Phosphatgruppen zu trennen. Proteinlysate stammen aus SCC9-Zellen, die mit dem DP-S-Tag-C-Terminus transfiziert und 3 Stunden lang entweder mit LiCl oder OA behandelt wurden. Das Phos-Tag-Gel wurde mit einem Anti-S-Tag-Antikörper analysiert, um die gesamte DP-S-Tag-Expression sichtbar zu machen. Die Quantifizierung des % phosphorylierten DP-Stag ist rechts. Der Prozentsatz der Hyperphosphorylierung wurde durch (Phosphorylierungssignal/Gesamtsignal)*100 berechnet, um einen endgültigen Prozentsatz zu erhalten. (C–F) SCC9s wurden 3 Stunden lang mit Inhibitoren behandelt, die entweder PP2A (50 und 100 nM OA) oder PP1 (250 nM Tautomycin) bevorzugen. Western-Blot-Analyse von S2849-phosphoryliertem DP (pDP) (C) und dem dualen S2845/S2849-phosphorylierten DP (ppDP) (D). (E) Immunfluoreszenzfärbung von S2849 phosphoryliertem DP (pDP) in medikamentenbehandelten SCC9. (F) Die Färbungsintensität von [E] wurde an der Membran unter Verwendung von PG-Färbung als Maske quantifiziert. (G) Die Menge des dualen S2845/S2849-phosphorylierten DP (ppDP) wurde in den gesamten SCC9-Zellen analysiert, die mit siRNA transfiziert wurden, die auf die PP2A-C-Untereinheit abzielt. Statistische Analysen wurden an normalisierten Daten unter Verwendung einer einfachen ANOVA mit mehreren Vergleichen (B–F) oder eines Student-t-Tests (G) durchgeführt. * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.

Diese Studie identifiziert das Proteinphosphatase 2A (PP2A)-B55α-Holoenzym als die Phosphatase, die für die Dephosphorylierung des C-Terminus von DP verantwortlich ist. Mit einer Kombination aus chemischen und genetischen Ansätzen zeigen wir, dass die Hemmung des PP2A-B55α-Holoenzyms einen Anstieg der DP-Phosphorylierung an Stellen interzellulärer Verbindungen induziert. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die regulatorische PP2A-Untereinheit B55α mit DP an interzellulären Membranen assoziiert ist, wo sowohl die DP- als auch die B55α-Lokalisation von der Expression des anderen abhängig sind. Schließlich zeigten Tests zur interzellulären Adhäsion von Keratinozyten, dass der Verlust des PP2A-B55α-Holoenzyms die durch das DP-C-Terminus-Phosphomotiv vermittelte interzelluläre Adhäsionsstärke verringert. Zusammengenommen offenbaren diese Daten die Existenz eines bisher unerkannten regulatorischen Moduls, das in der Lage ist, die Desmosomen-abhängige Adhäsion fein abzustimmen. Wir schlagen vor, dass dieses Modul einen Mechanismus für schnelle Anpassungen bereitstellt, die für die Aufrechterhaltung einer funktionellen Barriere in der dynamischen mechanischen Umgebung der Epidermis erforderlich sind.

Die Bedeutung von hypophosphoryliertem DP für die Stabilisierung der DP-IF-Wechselwirkung zur Stärkung der Desmosomen-vermittelten Adhäsion lässt auf die Existenz einer Phosphatase schließen, die DP in einer regulierten Angelegenheit dephosphoryliert. Um festzustellen, ob Serin/Threonin-Proteinphosphatasen an diesem Prozess beteiligt sind, wurden Keratinozyten mit dem Pan-Serin/Threonin-Phosphatase-Inhibitor Okadaic Acid (OA) behandelt. Um Vergleiche mit früheren Daten zu ermöglichen, die GSK3β und PRMT-1 als die Phosphorylierung des C-Terminus von DP regulierend identifizieren, haben wir uns zunächst für die Verwendung der Plattenepithelkarzinom-Zelllinie SCC914 entschieden. SCC9-Zellen wurden mit einer 32 kDa großen, verkürzten Form von DP (DP-S-Tag, Abb. 1A) transfiziert, die nur die C-terminale Domäne einschließlich der Reste 2628–287114 enthielt. DP-S-Tag-exprimierende Zellen wurden 3 Stunden lang mit 100 nM OA, 250 nM OA oder DMSO-Vehikelkontrolle behandelt. Als interne Kontrolle wurden die Zellen mit 40 mM Lithiumchlorid (LiCl) behandelt, einem GSK3β-Inhibitor, der bekanntermaßen einen hypophosphorylierten DP-C-Terminus induziert14. Zelllysate wurden gesammelt und auf Gelen laufen gelassen, die ein Phos-Tag-Peptid enthielten, das in der Lage ist, Proteine ​​basierend auf der Anzahl der vorhandenen Phosphatgruppen zu trennen20. Das Phos-Tag-Gel zeigte, dass die LiCl-Behandlung einen Anstieg des hypophosphorylierten DP hervorrief, was durch eine Akkumulation der untersten DP-S-Tag-Bande deutlich wurde (Abb. 1B). Die Behandlung mit 100 nM OA erhöhte die Intensität der zweiten Bande von unten, was einen Anstieg des teilweise phosphorylierten DP darstellt, während die Behandlung mit 250 nM OA zu einer Akkumulation der oberen S-Tag-Banden führte, die hyperphosphoryliertes DP darstellten. Die Quantifizierung des Phos-Tag-Gels erfolgte durch Bestimmung des gesamten DP-S-Tag-Signals und des hyperphosphorylierten DP-Stag-Signals. Der Prozentsatz der Hyperphosphorylierung wurde durch (hyperphosphoryliertes Signal/Gesamtsignal)*100 berechnet, um ein endgültiges Ergebnis zu erhalten Prozentsatz.

Um die Phosphatase zu identifizieren, die an der Dephosphorylierung des C-Terminus von DP beteiligt ist, verwendeten wir chemische Inhibitoren, die auf die beiden wichtigsten Serin/Threonin-Proteinphosphatasen abzielen, die zusammen etwa 90 % der gesamten Serin/Threonin-Phosphatase-Aktivität in Keratinozyten ausmachen, PP2A und PP1. Während Phosphataseinhibitoren eine Kreuzreaktivität in ihren Substraten aufweisen, ermöglicht ihre bevorzugte Selektivität eine unterschiedliche Hemmung von PP2A und PP1. OA hemmt bevorzugt PP2A (IC50 = ~ 0,1 nM) mit einer Affinität, die 10 × größer ist als die seines nächsten Hauptziels PP1 (IC50 = ~ 15 nM), während Tautomycin bevorzugt PP1 hemmt (PP1 IC50 = ~ 0,2 nM, PP2A IC50 = ~ 1 nM). )21. Daher wurden SCC9-Zellen 3 Stunden lang entweder mit 100 nM OA, 250 nM Tautomycin oder DMSO-Vehikelkontrolle behandelt. Ein Phospho-Antikörper, der für die S2849-Stelle am C-Terminus von DP spezifisch ist, wurde als Anzeige für die Phosphorylierung des DP-C-Terminus verwendet. Die Behandlung mit OA, jedoch nicht mit Tautomycin, erhöhte den Gehalt an phosphoryliertem DP in den gesamten Zelllysaten (Abb. 1C). Darüber hinaus induzierte die PP2A-Hemmung einen Anstieg einer doppelt phosphorylierten Form von DP, gemessen mit einem Antikörper, der auf die Reste S2845 und S2849 im DP-C-Terminus abzielt (Abb. 1D), was mit einer Rolle von PP2A bei der Regulierung mehrerer Reste im C-Terminus übereinstimmt -terminale Phospho-Serin-Kaskade.

Um festzustellen, ob die PP2A-Hemmung die DP-Phosphorylierung an Zell-Zell-Übergängen beeinflusst, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung von phosphoryliertem und Gesamt-DP in SCC9s durchgeführt, die 3 Stunden lang mit dem Arzneimittel behandelt wurden. Da sich die höhere Dosis von 100 nM OA nachteilig auf die Zellmorphologie und die Zellkontakte auswirkte, wurde neben 250 nM Tautomycin eine niedrigere Dosis, 50 nM OA, verwendet, die keine sichtbare Toxizität oder morphologische Auswirkungen hatte. Selbst mit 50 nM OA erhöhte sich die Menge an phosphoryliertem DP an Zell-Zell-Membranen fast um das Doppelte, während 250 nM Tautomycin keinen erkennbaren Einfluss auf die Menge an phosphoryliertem DP an der Zellmembran hatte (Abb. 1E–F). Darüber hinaus gab es keine nachweisbare Veränderung der Gesamtmenge an membranassoziiertem DP, was darauf hindeutet, dass die festgestellten Veränderungen spezifisch für die DP-Phosphorylierung waren. Dies steht im Einklang mit Daten, die in der spontan immortalisierten, nicht transformierten Keratinozytenzelllinie HaCaT (ergänzende Abbildung 1A) sowie in primären neonatalen menschlichen epidermalen Keratinozytenzellen (NHEK) (ergänzende Abbildung 1B) generiert wurden. Um weiter zu bestätigen, dass die Auswirkungen auf die DP-Phosphorylierung spezifisch auf die PP2A-Aktivität zurückzuführen sind, wurden SCC9-Zellen mit siRNA, die auf die katalytische Untereinheit von PP2A (PP2A-C) abzielt, oder einer Scramble-Kontrollsequenz transfiziert und 2 Tage lang bei Konfluenz gezüchtet. Ähnlich wie bei der OA-Behandlung erhöhte der Abbau von PP2A-C den Spiegel an doppelt phosphoryliertem DP (Abb. 1G). Dies blieb in HaCaT-Zellen konsistent, wo der Abbau von PP2A-C die Phospho-S2849-DP-Spiegel an Zellmembranen erhöhte (ergänzende Abbildung 2). Basierend auf diesen ersten Daten, die darauf hindeuten, dass PP2A und nicht PP1 für die Regulierung des C-Terminus von DP verantwortlich ist, konzentrierten wir uns auf die weitere Aufklärung der PP2A-DP-Beziehung.

DP kommt im Komplex mit der regulatorischen PP2A-Untereinheit B55⍺ in SCC9-Zellen vor. (A) Immunpräzipitation von endogenem DP unter Verwendung von Antikörpern, die auf den C-Terminus oder N-Terminus von DP abzielen, und Rückblotting für Dsg3 oder B55⍺. SCC9s (links) und NHEKs (rechts) wurden 2 Tage lang in Medien mit hohem Kalziumgehalt (HCM) gezüchtet. (B) Immunpräzipitation von endogenem B55⍺ und Rückblotting für DP oder Dsg3. SCC9s (links) und NHEKs (rechts) wurden 2 Tage lang in Medien mit hohem Kalziumgehalt (HCM) gezüchtet. (C) SCC9-Immunfluoreszenz, gemeinsam gefärbt für B55⍺, DP und ⍺-Catenin. Überlagerte Bilder werden unten angezeigt. Kolokalisierungsanalyse, ermittelt durch ein objektbasiertes Kolokalisierungsanalysetool, dargestellt als Überlappungskoeffizientenmessungen. (D) Proximity-Ligationsanalyse, durchgeführt an SCC9-Zellen, die mit siRNA transfiziert wurden, die entweder auf eine Scramble-Kontrolle, B55α oder DP abzielt. Ein fluoreszenzbasiertes PLA-Signal wurde auf fixierten Deckgläsern gemessen, die mit B55α- und DP-Targeting-Antikörpern inkubiert wurden. (E) Immunfluoreszenzfärbung von S2849 phosphoryliertem DP (pDP) in SCC9-Zellen, transfiziert mit siRNA, die auf die B55α-Untereinheit abzielt. Die Färbungsintensität wurde an der Membran unter Verwendung von PG-Färbung als Maske quantifiziert. (F) Die Menge des dualen S2845/S2849-phosphorylierten DP (ppDP) wurde in gesamten SCC9-Zellen analysiert, die mit siRNA transfiziert waren, die auf die B55α-Untereinheit abzielt. Statistische Analysen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit mehreren Vergleichen (A,D) oder eines Student-T-Tests (B–C,E–F) durchgeführt. * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.

PP2A ist ein heterotrimeres Protein, das aus einer Gerüstuntereinheit (A), einer katalytischen Untereinheit (C) und einer regulatorischen Untereinheit (B) besteht. Um das Holoenzym zu bilden, binden die A- und C-Untereinheiten eine von 23 verschiedenen Isoformen der B-Untereinheit, die für die Bindung der Substrate verantwortlich sind22. Um besser zu verstehen, wie PP2A DP reguliert, haben wir versucht, die B-Untereinheit zu identifizieren, die für die gezielte Steuerung von PP2A an DP verantwortlich ist. In einer unvoreingenommenen Proteomikstudie wurde festgestellt, dass DP an die B-Untereinheit B55α23 bindet. Darüber hinaus führte der Verlust von B55α sowohl im Zell- als auch im Mausmodell zu einer beeinträchtigten Entwicklung der epidermalen Barriere24,25,26,27. Basierend auf diesen Berichten haben wir uns vorgenommen, das Ausmaß zu untersuchen, in dem B55α und DP in Keratinozyten assoziieren.

Zu diesem Zweck wurde ein Co-Immunpräzipitationstest (Co-IP) durchgeführt, um endogene DP-Komplexe mithilfe von zwei verschiedenen DP-gerichteten Antikörpern abzubauen, die auf die C- und N-Termini von DP sowohl in SCC9- als auch in NHEK-Zellen abzielen. Sowohl die auf den C- als auch den N-Terminus gerichteten Antikörper zogen erwartungsgemäß desmosomales Cadherin Dsg3 herunter. Darüber hinaus war B55α im Vergleich zur IgG-Kontrolle auch in beiden IP-Komplexen angereichert (Abb. 2A). Eine Co-IP unter Verwendung eines Antikörpers, der auf endogenes B55α abzielt, führte im Vergleich zur Kontrolle ebenfalls zu einer Anreicherung von DP, interessanterweise jedoch nicht zu einer Anreicherung von Dsg3, was darauf hindeutet, dass B55α möglicherweise bevorzugt mit DP interagiert (Abb. 2B).

Um die mögliche Co-Lokalisierung von B55α-DP zu untersuchen, wurde eine Immunfluoreszenz an SCC9-Zellen durchgeführt, die B55α entweder mit DP oder einem anderen membranassoziierten Protein, einschließlich des adhärenten Verbindungszytoskelett-Linkerproteins α-Catenin, gemeinsam anfärbten. Die B55α-Färbung ähnelte eher der DP-Lokalisierung als der α-Catenin-Färbung (Abb. 2C). Die Kolokalisierung wurde mithilfe eines objektbasierten Analysetools quantifiziert und ergab eine deutlich höhere Kolokalisierung zwischen B55α/DP als B55α/α-Catenin28. Die Färbung von SCC9-Zellen, die mit auf B55α ausgerichteter siRNA transfiziert waren, bestätigte, dass das membranlokalisierte B55α-Signal spezifisch für das B55α-Protein ist (ergänzende Abbildung 3A). Bemerkenswerterweise war der Verlust von B55α mit einer Abnahme der Gesamtmenge an DP an der Zellmembran verbunden, was darauf hindeutet, dass B55α die DP-Dynamik regulieren könnte (ergänzende Abbildung 3A). Darüber hinaus fiel der Verlust von DP mit dem Verlust von membranassoziiertem B55α zusammen, was die Annahme stützt, dass B55α physikalisch an DP an der Membran verankert ist.

B55alpha kommt in vitro und in vivo lokalisiert an Stellen interzellulärer Membranen in der 3D-Epidermis vor. (A–B) 3D-organotypisch rekonstruierte Hautkulturen, die 6 Tage lang in Kultur gezüchtet wurden, und es wurde eine Immunfluoreszenzfärbung von B55⍺, DP und PG (A) und B55⍺, α-Catenin und PG (B) durchgeführt. (C) Kolokalisierungsanalyse von (A–B), bestimmt durch ein objektbasiertes Kolokalisierungsanalysetool, dargestellt als Überlappungskoeffizientenmessungen. (D) Menschliche Hautproben wurden mittels Immunfluoreszenz auf B55⍺ und DP gefärbt. (E) Kolokalisierungsanalyse von (D) und (ergänzende Abbildung 4D), ermittelt durch ein objektbasiertes Kolokalisierungsanalysetool, dargestellt als Überlappungskoeffizientenmessungen. (F–G) Proximity-Ligationsanalyse, durchgeführt an fixierten menschlichen Hautproben. Ein fluoreszenzbasiertes PLA-Signal wurde auf fixierten Objektträgern gemessen, die entweder mit B55α- und DP-Targeting-Antikörpern oder B55α und IgG inkubiert wurden. Statistische Analysen wurden mithilfe eines Student-T-Tests durchgeführt. * < 0,05; ** < 0,01.

Um diese Wechselwirkung in Zellen zu validieren, wurde ein Proximity-Ligation-Assay (PLA) unter Verwendung von Antikörpern gegen B55α und DP in SCC9s durchgeführt, die mit siRNA transfiziert waren, die entweder auf eine Scramble-Kontrolle, B55α oder DP29 abzielte. In Übereinstimmung mit der Kolokalisierungsanalyse erzeugte PLA ein signifikantes Signal in den Scramble-Kontrollzellen, das durch den Abbau von B55α oder DP verloren ging, was bestätigt, dass das PLA-Signal auf die enge Nähe zwischen den beiden Proteinen innerhalb der Zellen zurückzuführen ist (Abb. 2D, Ergänzende Abbildung 3B). Um die funktionelle Bedeutung des DP-B55α-Komplexes zu bestimmen, wurden SCC9-Zellen mit siRNA, die auf B55α abzielt, transfiziert und zwei Tage lang bei Konfluenz gezüchtet. Die Immunfluoreszenzfärbung führte zu einem Anstieg des S2849-phosphorylierten DP an Zellmembranen (Abb. 2E, ergänzende Abb. 3C). Darüber hinaus bestätigte die Western-Blot-Analyse, dass der Abbau von B55α den Spiegel an doppelt phosphoryliertem DP in den Zellen erhöhte (Abb. 2F).

Um festzustellen, ob ein B55α/DP-Komplex auch in Geweben vorhanden ist, wurde ein 3D-organotypisch rekonstruiertes epidermales Floßmodell, das 6 Tage lang gezüchtet wurde, gemeinsam auf B55α und DP gefärbt. In Übereinstimmung mit den zellulären Daten wurde festgestellt, dass B55α an der Membran in einem Muster lokalisiert ist, das eher DP ähnelt als PG oder α-Catenin (Abb. 3A – B, ergänzende Abb. 4A). Darüber hinaus ergab die objektbasierte Kolokalisierungsanalyse, dass B55α einen höheren Überlappungskoeffizienten mit DP aufwies als mit PG oder α-Catenin (Abb. 3C, ergänzende Abb. 4B). Angefärbte menschliche Hautproben zeigten auch, dass B55α vorzugsweise mit DP an der Membran innerhalb der intakten Epidermis kolokalisiert, was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkung in vivo aufrechterhalten wird (Abb. 3D – E, ergänzende Abb. 4C – D). Um die B55α-DP-Wechselwirkung in vivo direkter zu untersuchen, wurde PLA an menschlichen Hautproben unter Verwendung von B55α- und DP-gerichteten Sonden durchgeführt und mit Proben verglichen, die nur mit B55α-Antikörper oder IgG behandelt wurden. In Übereinstimmung mit den Zelldaten wurde das PLA-Signal im Vergleich zu den Kontrollen robust erkannt, was die Schlussfolgerung weiter stützt, dass B55α in der intakten geschichteten Epidermis einen Komplex mit DP bildet (Abb. 3F – G).

PP2A-B55alpha reguliert die Adhäsion und Barriere von Epithelzellen durch DP. (A) Ein Dispase-Adhäsionstest wurde in SCC9s durchgeführt, die mit siRNA für Scramble, B55⍺ oder DP transfiziert und 5 Tage lang in normalem HCM gezüchtet wurden. Die Bilder zeigen SCC9-Monoschichten vor (links) und nach (rechts) der mechanischen Beanspruchung. (B) Die Monolayer-Fragmentierung von (A) wurde quantifiziert und als Gesamtfragmentzahl von n = 5 dargestellt. (C) Western-Blot-Validierung des siRNA-Knockdowns in (A). (D) Ein Dispase-Adhäsionstest wurde in A431-Zellen durchgeführt, die entweder dox-induzierbares DPserGFP oder DPglyGFP exprimierten und mit siRNA transfiziert wurden, die auf Scramble, B55⍺ oder DP abzielte. Die Zellen wurden 6 Tage lang in normalem HCM mit 1 μg/ml Dox gezüchtet. Die Bilder zeigen A431-Monoschichten vor (links) und nach (rechts) der mechanischen Beanspruchung. (E) Die Monolayer-Fragmentierung von (A) wurde quantifiziert und als Gesamtfragmentzahl von n = 4 dargestellt. (F) Western-Blot-Validierung des siRNA-Knockdowns in (C). Statistische Analysen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. * < 0,05; ** < .01.

Unsere Gruppe berichtete zuvor, dass die ektopische Expression des konstitutiv hypophosphorylierten DP-C-Terminus die Adhäsionsstärke erhöht17. Daher waren wir daran interessiert, die Rolle von PP2A-B55α bei der Regulierung der Keratinozytenadhäsion durch die Phosphoregulation von DP zu identifizieren. An SCC9-Zellen wurde ein Dispase-basierter Adhäsionstest durchgeführt, bei dem entweder die katalytische PP2A-Untereinheit (PP2A-C) oder die regulatorische B55α-Untereinheit mithilfe von siRNA abgebaut wurde. Die Zellen wurden 5 Tage lang in vollständig konfluenten Monoschichten gezüchtet und mittels Dispase-Behandlung wurden die Zellmonoschichten von der Kulturplatte abgehoben, bevor die Monoschichten in Röhrchen transportiert wurden, um durch Inversion eine mechanische Störung zu erfahren. Die Haftfestigkeit wurde durch Aufzeichnung des Fragmentierungsgrads der Monoschichten bestimmt. Die Stummschaltung von PP2A-C oder B55α führte im Vergleich zu den Kontrollen zu deutlich mehr Monoschichtfragmenten (Abb. 4A–C). Bemerkenswert ist, dass mit siDP behandelte Zellen zu einer vollständigen Fragmentierung der Zellmonoschichten führten, was darauf hindeutet, dass der Verlust von PP2A-B55α die DP-Funktion nur teilweise stört.

Um zu bestimmen, inwieweit die Auswirkungen des PP2A-B55α-Verlusts auf die Adhäsion auf die Phosphoregulation des DP-C-Terminus zurückzuführen sind, verwendeten wir A431-Zellen, die entweder ein Dox-induzierbares DP-GFP-Konstrukt exprimierten, das Wildtyp-DP (DPserGFP) exprimierte. oder eine zuvor beschriebene konstitutiv hypophosphorylierte S2849G-DP-Mutante (DPglyGFP)17. Die A431-Zellen wurden mit siRNA transfiziert, die entweder auf eine Scramble-Kontrolle, PP2A-C oder B55α abzielte. Nach der Transfektion wurden die Zellen 6 Tage lang bei Konfluenz in Medien mit 1 μg/ml Dox gezüchtet, bevor Monoschichten unter Verwendung einer Dispase-Behandlung gesammelt und einer mechanischen Rotation unterzogen wurden. In Übereinstimmung mit den SCC9-Daten erhöhte der PP2A-C- und B55α-Knockdown die Fragmentierung in DPserGFP-exprimierenden Zellen (Abb. 4D – F). Darüber hinaus führte die DPglyGFP-Expression im Einklang mit früheren Berichten zu einer geringeren Fragmentierung in Scramble-Kontrollzellen im Vergleich zur DPserGFP-Expression. Der Abbau von PP2A-C und B55α hatte jedoch keinen Einfluss auf die Fragmentierung in den DPglyGFP-exprimierenden Zellen, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit von PP2A-B55α zur Regulierung der Keratinozytenadhäsion von der Phosphoregulation des C-Terminus von DP abhängt. Zusammenfassend stellen diese Studien PP2A-B55α als ein molekulares Modul dar, das in der Lage ist, die Haftfestigkeit von Keratinozyten als Reaktion auf ihre sich ändernden mechanischen Umgebungen zu verändern.

Durch die Identifizierung der Phosphatase, die auf das Phosphomotiv am DP-C-Terminus einwirkt, haben wir eine große Lücke in unserem Verständnis darüber geschlossen, wie die Verbindung zwischen Desmosom und Zwischenfilament durch Regulierung des DP-Phosphorylierungszustands abgestimmt wird. Unsere Arbeit zeigt, dass das PP2A-B55α-Holoenzym mit dem desmosomalen Zytoskelett-Linker DP assoziiert ist und der Verlust seiner Aktivität zu einem Anstieg des gesamten einfach und doppelt phosphorylierten DP sowie zur Akkumulation von hyperphosphoryliertem DP führt, das an Zell-Zell-Verbindungen konzentriert ist. Wir haben weiterhin gezeigt, dass die durch die Hemmung von PP2A-B55α induzierte DP-Phosphorylierung die interzelluläre Adhäsion schwächt, vermutlich durch eine Abnahme der DP-IF-Verbindungsstärke. Die Bedeutung des DP-C-terminalen GSR-Motivs als Ziel für die PP2A-B55α-Regulation wird durch die Tatsache gestützt, dass die DP-S2849G-Mutante vor der beobachteten Abnahme der Adhäsion aufgrund der genetischen Erschöpfung von B55α oder der katalytischen PP2A-Untereinheit schützt. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Enzyme GSK3β und PRMT-1 bei der Vermittlung der DP-Phosphorylierung zusammenarbeiten. Zusammen mit der aktuellen Arbeit schlagen wir einen aktualisierten Regulierungsmechanismus vor, bei dem PP2A-B55α und PRMT-1/GSK3β durch die Phospho-Regulierung des C-Terminus von DP einen molekularen Schalter bilden, um die DP-IF-Verbindung, die die Zelladhäsion steuert, fein abzustimmen und Zugfestigkeit (Abb. 5).

Ein Gleichgewicht zwischen PP2A-B55alpha- und GSK3β/PRMT1-Aktivitäten am C-Terminus von DP steuert die Desmosomen-Adhäsionsstärke durch Regulierung der DP-IF-Verbindung. Ein Schema, das den regulatorischen Schalter darstellt, der die desmosomenvermittelte Adhäsion durch die Phosphoregulation der DP-IF-Wechselwirkung steuert. Albrecht et al. zuvor identifizierten GSK3β und PRMT1 eine Zusammenarbeit, um die Phosphorylierung des C-Terminus von DP zu induzieren, die die DP-IF-Bindung hemmt und die desmosomale Adhäsion schwächt. Unsere Arbeit hat PP2A-B55α als entgegengesetzten regulatorischen Knoten aufgedeckt, der in der Lage ist, den C-Terminus von DP zu dephosphorylieren, was möglicherweise durch eine verstärkte Assoziation zwischen DP und IF eine erhöhte Zelladhäsion induziert.

Die PP2A-B55α-Aktivität wurde mit der Regulierung mehrerer zellulärer Prozesse in Verbindung gebracht, darunter Zellwachstum, DNA-Replikation, mitotischer Austritt, Zytokinese und Mikrotubuli-Integrität30,31. Zu den am besten charakterisierten Substraten gehören das Tubulin-bindende Protein Tau, das Spindelregulationsprotein PRC1, das Taschenprotein p107 und viele der CDK1-Zellzyklussubstrate. Aufgrund der starken Überlappung von B55α-Substraten und der Zellzyklusregulation wurde PP2A-B55α in erster Linie als zellzyklusregulierendes Enzym angesehen. Unsere Arbeit stellt eine potenzielle Rolle des Zellzyklusregulators PP2A-B55α bei nicht replizierenden differenzierten Keratinozyten dar, die ein hohes Maß an interzellulärer Spannung erfahren, die einen starken Desmosomen-IF-Anker erfordert und keine hohe Zellzyklusregulierung mehr erfordern.

Jüngste Arbeiten an Kardiomyozyten und einfachen Epithelien zeigten, dass Desmosome mechanosensitive Strukturen sind, die auf mechanischen Stress reagieren, indem sie Desmosomenproteine ​​an Stellen der Zell-Zell-Adhäsion rekrutieren32,33. Trotz dieser Berichte ist unklar, wie sich das Desmosom unterschiedlich auf die epidermale Mechanik in der geschichteten Epidermis auswirken kann. Ein möglicher Mechanismus könnten seine Zytoskelettverbindungen sein. In Übereinstimmung mit dieser Idee hemmt eine Störung der DP-IF-Wechselwirkung die Bildung von Tight Junctions in 3D-Modellen, was ihre Bedeutung für die Funktion der epidermalen Barriere untermauert34,35. Angesichts unserer früheren Beobachtung, dass ein Hypo-Phosphomimic von DP die Steifheit der Epithelschicht erhöht19, lassen unsere Daten darauf schließen, dass die Abstimmung der DP-IF-Wechselwirkungen durch PP2A-B55α-vermittelte Dephosphorylierung zu dem Steifheitsgradienten beitragen könnte, von dem kürzlich berichtet wurde, dass er in der geschichteten Epidermis existiert36. Eine erhöhte Spannung in der oberflächlichen Epidermis würde wiederum dazu beitragen, enge Verbindungen im oberflächlichen Stratum granulosum 2 (SG2) aufrechtzuerhalten. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigen, dass die katalytische Aktivität von PP2A und die regulatorische Untereinheit von B55α speziell für die normale epidermale Entwicklung, die Barrierefunktion und insbesondere die Bildung enger Verbindungen in zellulären und in vivo-Modellen des PP2A-Verlusts24,25,26,27 erforderlich sind. Darüber hinaus verbesserte die PP2A-Aktivierung durch topische Pflanzenextraktbehandlungen die epidermale Barrierefunktion bei Menschen37. Zusammengenommen decken diese Daten einen möglichen Mechanismus auf, der erklärt, wie das PP2A-B55α-Holoenzym sowohl die epidermale Barriere als auch die Gewebemechanik reguliert.

Die Bedeutung der DP-IF-Assoziation wird durch die schweren Herz-Kreislauf-Erkrankungen unterstrichen, die mit Mutationen in der C-Terminus-Domäne von DP einhergehen, die die IF-Bindungsstelle und das phosphoregulatorische Motiv beeinträchtigen9,13. Dazu gehören die kardiokutane Erkrankung Carvajal-Syndrom, die mit einer Verkürzungsmutation am C-Terminus von DP einhergeht, und die Desmosomen-bedingte Erkrankung AC10,38,39. AC ist mit Mutationen in mehreren Desmosomenkomponenten verbunden, einschließlich einer Punktmutation im C-Terminus von DP, die die ordnungsgemäße Regulierung des phosphoregulatorischen Motivs stört, das wir als Ziel von PP2A-B55α identifiziert haben. Darüber hinaus reichte die ektopische Expression einer konstitutiv hypophosphorylierten DP-Mutante aus, um die IF-Verteilung wiederherzustellen und die Zell-Zell-Adhäsion in einem Desmosomen-Mangelkrankheitsmodell von Pemphigus vulgaris aufrechtzuerhalten40. Bemerkenswert ist, dass nur die Hälfte aller AC-Fälle mit Mutationen in bekannten Desmosomenkomponenten in Verbindung gebracht werden39. Die Identifizierung von PP2A-B55α als Regulator des C-terminalen Phosphomotivs von DP lässt vermuten, dass Mutationen im PP2A-B55α-Komplex ein Kandidat für desmosomale Erkrankungen bei Patienten ohne identifizierte Desmosommutation sein könnten. Schließlich lässt eine zuvor veröffentlichte Gemeinschaftsarbeit, die zeigt, dass die PP2A-Hemmung die Phosphorylierung einer konservierten Sequenz im weit verbreiteteren Verwandten der Plakin-Familie, Plectin, steigert, die Möglichkeit aufkommen, dass B55α eine umfassendere regulatorische Rolle für Plakine in verschiedenen Gewebetypen, einschließlich Herz- und Skelettmuskeln, spielen könnte41.

Zusammenfassend haben wir PP2A-B55α als eine neu erkannte Komponente eines molekularen Schalters identifiziert, der auch PRMT-1/GSK3β enthält. Aufgrund seiner Fähigkeit, ein kritisches Phosphomotiv am C-Terminus von DP negativ zu regulieren, schlagen wir vor, dass PP2A-B55α die durch Desmosomen vermittelte Adhäsion optimiert, um Desmosomen dynamische Eigenschaften zu verleihen, die für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der epidermalen Barriere erforderlich sind.

Vom Menschen stammende orale Plattenepithelkarzinom-SCC9-Zellen (ein Geschenk von J. Rheinwald, Harvard Medical School, Boston, MA) wurden in DMEM/F12, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin kultiviert. Immortalisierte menschliche Keratinozyten-HaCaT-Zellen wurden in DMEM, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zelllinien wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten. Normale menschliche epidermale Keratinozyten (NHEKs) werden aus der Vorhaut von Neugeborenen isoliert, die vom Northwestern University Skin Biology and Diseases Resource-based Center (SBDRC) bereitgestellt wird, wie zuvor beschrieben 42. NHEKs wurden in M154-Wachstumsmedium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 0,07 mM CaCl2, gehalten , menschliches Keratinozyten-Wachstumspräparat (HKGS; Thermo Fisher Scientific), Gentamicin und Amphotericin B. NHEKs wurden verwendet, um 3D-rekonstruierte epidermale organotypische Kulturen wie zuvor beschrieben zu erzeugen 42.

Für die siRNA-Transfektion wurden die Zellen ausplattiert und über Nacht bis zu einer Konfluenz von 60 % gezüchtet, bevor sie mit Dharmafect (Thermo Fisher Scientific) transfektioniert wurden. Dharmacon ON-TARGET-siRNAs (Horizon Discovery) wurden verwendet, um auf PP2A-C (J-003598–09) und B55α (J-004824–06) abzuzielen. Für Arzneimittelbehandlungsstudien wurden die Zellen 3 Tage lang bei Konfluenz gezüchtet, bevor sie 3 Stunden lang mit OA (50 nM oder 100 nM), Tautomycin (250 nM) oder DMSO behandelt wurden. Doxycyclin (Sigma Aldrich) wurde in Konzentrationen von 1 μg/ml verwendet. NHEKs wurden bis zur Konfluenz gezüchtet und vor der medikamentösen Behandlung 2 Tage lang in Wachstumsmediumzusatz mit 1,2 mM CaCl2 inkubiert.

Auf Glasdeckgläsern plattierte Zellen wurden entweder 3 Minuten lang in wasserfreiem eiskaltem Methanol auf Eis fixiert, um die Phospho-S2849-DP/Gesamt-DP-Färbung sichtbar zu machen, oder 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd (PFA)-Lösung bei Raumtemperatur, gefolgt von wasserfreiem eiskaltem Methanol für 3 Minuten auf Eis, um B55α sichtbar zu machen. Die Zellen wurden entweder mit 5 % Ziegenserum oder 1 % BSA und 1 % Eselserum blockiert. Alle Proben wurden mit ProLong Gold Antifade-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) auf Objektträger montiert. 3D-rekonstruierte Haut- und menschliche Hautproben wurden aus gefrorenen eingebetteten Proben gefärbt und wie oben beschrieben fixiert. Für die PLA-Analyse wurden die Proben wie oben beschrieben fixiert und die PLA wurde wie in Hegazy et. beschrieben durchgeführt. al29.

Apotome-Bilder wurden mit der ZEN 2.3-Software mit einem Epifluoreszenzmikroskopsystem (Axio Imager Z2, Carl Zeiss) aufgenommen, das mit einem X-Cite 120 LED Boost System, einem Apotome.2-Objektträgermodul, einer Axiocam 503 Mono-Digitalkamera und einem Plan-Apochromat ausgestattet war 40x/1,4, Plan-Apochromat 63x/1,4 Objektiv, Plan-Apochromat 100x/1,4 Objektiv (Carl Zeiss). Bilder werden mit der ImageJ-Software verarbeitet. Die Kolokalisierungsanalyse wurde mit dem JaCoP ImageJ-Plugin28 durchgeführt.

Ganzzelllysate wurden unter Verwendung von Harnstoffprobenpuffer (8 M Harnstoff, 1 % SDS, 60 mM Tris, pH 6,8, 5 % b-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin) erzeugt. Die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. 5 % Milch wurde verwendet, um Membranen zu blockieren und primäre und sekundäre Antikörper zu verdünnen. Immunreaktive Proteine ​​wurden mithilfe von Chemilumineszenz- oder LI-COR-Fluoreszenz-Sekundärantikörpern sichtbar gemacht. Bilder aller nicht zugeschnittenen Blots sind in der ergänzenden Abbildung 5 enthalten.

Die Phosphataffinitäts-SDS-PAGE wurde unter Verwendung von Phos-tag (Wako Pure Chemical Industries) durchgeführt. Das Verfahren wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt (http://www.phos-tag.com). 50 μM Phos-Tag-Acrylamidpeptid werden während der Herstellung eines Polyacrylamidgels mit 15 % Gewicht/Volumen hinzugefügt. Die Gelelektrophorese wurde 5,5 Stunden lang bei 15 mA durchgeführt und über Nacht auf eine PVDF-Membran übertragen. Das anschließende Immunblotting wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Quantifizierung der Banden wurde mit der Image Studio-Software (LI-COR) durchgeführt.

Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: NW6 Rabbit anti-DP C-terminal43; NW161 Kaninchen-Anti-DP-N-Terminal44; 11-5F Maus-Anti-DP-C-Terminal (Sigma, Geschenk von D. Garrod45); Anti-Phospho-S2849 DP14,41; Anti-Dual-Phospho-S2845- und S2849-DP, erzeugt gegen ein synthetisches Peptid, das 2843–2853 des menschlichen DP entspricht (21st Century Biochemicals)14; Anti-Desmoglein 3 5G11 (Sigma-Aldrich); 1407 Hühner-Anti-PG (Aves Laboratories); 2G9 Maus-Anti-B55α (Cell Signaling Technology); PA5-18512 Ziegen-Anti-α-Catenin (Thermo Fisher Scientific); PA5-17443 Kaninchen-Anti-α-Catenin (Thermo Fisher Scientific); Maus-Anti-S-Tag (EMD Millipore); Maus-Anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology); 12G10 Maus-Anti-α-Tubulin (Developmental Hybridoma Studies Bank); JL-8 Maus-Anti-GFP (Clontech). Die folgenden Sekundärantikörper wurden verwendet: Ziegen-Anti-Maus-IgG HRP (Cell Signaling Technologies); Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG HRP (Cell Signaling Technology); Ziegen-Anti-Maus, konjugiert mit Alexa Fluor-488 (Thermo Fisher Scientific); Ziegen-Anti-Maus, konjugiert mit Alexa Fluor-568 (Thermo Fisher Scientific); Ziegen-Anti-Huhn, konjugiert mit Alexa Fluor-647 (Thermo Fisher Scientific); Esel-Anti-Ziege, konjugiert mit Alexa Fluor-488 (Thermo Fisher Scientific); Esel-Anti-Maus, konjugiert mit Alexa Fluor-568 (Thermo Fisher Scientific); Esel-Anti-Kaninchen, konjugiert mit Alexa Fluor-647 (Thermo Fisher Scientific).

3 Tage lang bei Konfluenz gezüchtete Zellen wurden 30 Minuten lang in NP40-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 0,2 % NP40, 10 % Glycerin, mit Proteaseinhibitortablette) auf Eis lysiert. Der Überstand wurde durch Zentrifugation gesammelt und über Nacht bei 4 °C rotierend mit an Agarose konjugierten Anti-DP-Antikörpern oder Anti-B55α-Antikörpern (Sant Cruz Biotechnology) inkubiert. Agarose-konjugiertes Protein A/G wurde vor der Zentrifugation 1 Stunde lang bei 4 °C rotiert und in 1 × NP40-Puffer gewaschen. Die Proben wurden in 3× Lamelli-Puffer resuspendiert und 10 Minuten lang bei 100 °C gekocht, bevor die Western-Blot-Analyse durchgeführt wurde.

Zellmonoschichten wurden 5 Tage lang dreifach in Platten mit 12 Vertiefungen bei Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und 30 Minuten lang mit 2,4 U/ml Dispase (Sigma Millipore), verdünnt in PBS mit Ca2+, behandelt. Angehobene Monoschichten wurden in konische 15-ml-Röhrchen mit 3 ml PBS gegeben und in ein Gestell gestellt. Das Gestell wurde 5–10 Mal umgedreht, wie in (Hudson et al.)46 beschrieben. Die resultierenden Fragmente wurden in Schalen mit 12 Vertiefungen zurückgegeben und unter Verwendung eines Präpariermikroskops (MZ6; Leica) abgebildet.

Während der aktuellen Studie wurden keine großen Datensätze generiert oder analysiert. Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Broussard, JA et al. Ausweitung der Mechanik einzelner Zellen auf mehrzellige Gewebe – die Rolle des intermediären Filament-Desmosom-Netzwerks. J. Zelle. Wissenschaft. https://doi.org/10.1242/jcs.228031 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hatzfeld, M., Keil, R. & Magin, TM Desmosomen und Zwischenfilamente: Ihre Konsequenzen für die Gewebemechanik. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a029157 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Getsios, S., Huen, AC & Green, KJ Erforschung der Stärke und Flexibilität von Desmosomen. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 5, 271–281. https://doi.org/10.1038/nrm1356 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vasioukhin, V., Bowers, E., Bauer, C., Degenstein, L. & Fuchs, E. Desmoplakin ist essentiell für die Bildung epidermaler Schichten. Nat. Zellbiol. 3, 1076–1085. https://doi.org/10.1038/ncb1201-1076 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gallicano, GI, Bauer, C. & Fuchs, E. Die Rettung der Desmoplakin-Funktion im extraembryonalen Ektoderm zeigt die Bedeutung dieses Proteins im embryonalen Herzen, im Neuroepithel, in der Haut und im Gefäßsystem. Entwicklung 128, 929–941. https://doi.org/10.1242/dev.128.6.929 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gallicano, GI et al. Desmoplakin wird zu Beginn der Entwicklung für den Aufbau von Desmosomen und die Zytoskelettverknüpfung benötigt. J. Cell Biol. 143, 2009–2022. https://doi.org/10.1083/jcb.143.7.2009 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Al-Owain, M. et al. Neuartige homozygote Mutation im DSP, die das Hautfragilitäts-Wollhaar-Syndrom verursacht: Bericht einer großen Familie und Übersicht über die Desmoplakin-bezogenen Phänotypen. Klin. Genet. 80, 50–58. https://doi.org/10.1111/j.1399-0004.2010.01518.x (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hobbs, RP et al. Erkenntnisse aus einer Desmoplakin-Mutation, die bei der tödlichen akantholytischen Epidermolysis bullosa identifiziert wurde. J. Invest. Dermatol. 130, 2680–2683. https://doi.org/10.1038/jid.2010.189 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jonkman, MF et al. Der Verlust des Desmoplakin-Schwanzes führt zur tödlichen akantholytischen Epidermolysis bullosa. Bin. J. Hum. Genet. 77, 653–660. https://doi.org/10.1086/496901 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pigors, M. et al. Desmoplakin-Mutationen mit palmoplantarer Keratodermie, wolligem Haar und Kardiomyopathie. Acta Derm. Venereol. 95, 337–340. https://doi.org/10.2340/00015555-1974 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Petrof, G., Mellerio, JE & McGrath, JA Desmosomale Genodermatosen. Br. J. Dermatol. 166, 36–45. https://doi.org/10.1111/j.1365-2133.2011.10640.x (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, Q., Wine Lee, L., Hall, EK, Choate, KA & Elder, RW Haare und Haut sagen Kardiomyopathien voraus: Carvajal- und Erythrokeratodermie-Kardiomyopathie-Syndrome. Pädiatr. Dermatol. 38, 31–38. https://doi.org/10.1111/pde.14478 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Lai Cheong, JE, Wessagowit, V. & McGrath, JA Molekulare Anomalien des desmosomalen Proteins Desmoplakin bei Erkrankungen des Menschen. Klin. Exp. Dermatol. 30, 261–266. https://doi.org/10.1111/j.1365-2230.2005.01736.x (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Albrecht, LV et al. GSK3- und PRMT-1-abhängige Modifikationen von Desmoplakin steuern die Desmoplakin-Zytoskelett-Dynamik. J. Cell Biol. 208, 597–612. https://doi.org/10.1083/jcb.201406020 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stappenbeck, TS, Lamb, JA, Corcoran, CM & Green, KJ Die Phosphorylierung des Desmoplakin-COOH-Terminus reguliert negativ seine Interaktion mit Keratin-Zwischenfilamentnetzwerken. J. Biol. Chem. 269, 29351–29354 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Godsel, LM et al. Dynamik der Desmoplakin-Assemblierung in vier Dimensionen: mehrere Phasen, die durch Zwischenfilamente und Aktin unterschiedlich reguliert werden. J. Cell Biol. 171, 1045–1059. https://doi.org/10.1083/jcb.200510038 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hobbs, RP & Green, KJ Desmoplakin reguliert die Desmosom-Hyperadhäsion. J. Invest. Dermatol. 132, 482–485. https://doi.org/10.1038/jid.2011.318 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bartle, EI et al. Der Proteinaustausch ist in kalziumunabhängigen Epithelverbindungen reduziert. J. Cell Biol. https://doi.org/10.1083/jcb.201906153 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Broussard, JA et al. Die Desmoplakin-Zwischenfilament-Verbindung reguliert die Zellmechanik. Mol. Biol. Zelle 28, 3156–3164. https://doi.org/10.1091/mbc.E16-07-0520 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horinouchi, T., Terada, K., Higashi, T. & Miwa, S. Verwendung von Phos-Tag in der Western-Blot-Analyse zur Bewertung der Proteinphosphorylierung. Methoden Mol. Biol. 1397, 267–277. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3353-2_18 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, M., Yogesha, SD, Mayfield, JE, Gill, GN und Zhang, Y. Betrachtung von Serin/Threonin-Proteinphosphatasen aus der Sicht von Arzneimittelentwicklern. Febr. J. 280, 4739–4760. https://doi.org/10.1111/febs.12481 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Connor, CM, Perl, A., Leonard, D., Sangodkar, J. & Narla, G. Therapeutisches Targeting von PP2A. Int. J. Biochem. Zellbiol. 96, 182–193. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2017.10.008 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Glatter, T., Wepf, A., Aebersold, R. & Gstaiger, M. Ein integrierter Workflow zur Darstellung des menschlichen Interaktionsproteoms: Einblicke in das PP2A-System. Mol. Syst. Biol. 5, 237. https://doi.org/10.1038/msb.2008.75 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Panicker, N. et al. Ppp2r2a-Knockout-Mäuse zeigen, dass die regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 2A, PP2A-B55α, ein wesentlicher Regulator der neuronalen und epidermalen Embryonalentwicklung ist. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 8, 358. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00358 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Shaughnessy, RF, Welti, JC, Sully, K. & Byrne, C. Akt-abhängige Pp2a-Aktivität ist für die Bildung einer epidermalen Barriere während der späten Embryonalentwicklung erforderlich. Entwicklung 136, 3423–3431. https://doi.org/10.1242/dev.037010 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Youssef, G. et al. Rab3Gap1 vermittelt die Exozytose von Claudin-1 und die Bildung enger Verbindungen während der Erfassung der epidermalen Barriere. Entwickler Biol. 380, 274–285. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2013.04.034 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gerner, L., Youssef, G. & O'Shaughnessy, RF Die regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 2A Ppp2r2a ist für die Dephosphorlyse von Connexin-43 während der Erfassung der epidermalen Barriere erforderlich. Exp. Dermatol. 22, 754–756. https://doi.org/10.1111/exd.12234 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bolte, S. & Cordelieres, FP Eine Führung durch die subzelluläre Kolokalisationsanalyse in der Lichtmikroskopie. J. Microsc. 224, 213–232. https://doi.org/10.1111/j.1365-2818.2006.01706.x (2006).

Artikel MathSciNet CAS PubMed Google Scholar

Hegazy, M. et al. Proximity-Ligationsassay zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinmodifikationen in Zellen und Geweben in situ. Curr. Protokoll. Zellbiol. 89, e115. https://doi.org/10.1002/cpcb.115 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amin, P. et al. PP2A-B55: Substrate und Regulatoren bei der Steuerung zellulärer Funktionen. Onkogen 41, 1–14. https://doi.org/10.1038/s41388-021-02068-x (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fowle, H., Zhao, Z. & Graña, X. PP2A-Holoenzyme, Substratspezifität, die Zellfunktionen und Deregulierung bei Krebs steuert. Adv. Krebs Res. 144, 55–93. https://doi.org/10.1016/bs.acr.2019.03.009 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, AJ et al. Die mechanische Belastung von Desmosomen hängt von der Stärke und Ausrichtung des äußeren Stresses ab. Nat. Komm. 9, 5284. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07523-0 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bliley, JM et al. Die dynamische Belastung von menschlich hergestelltem Herzgewebe verbessert die kontraktile Funktion und treibt einen Desmosomen-assoziierten Krankheitsphänotyp voran. Wissenschaft. Übers. Med. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abd1817 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Broussard, JA, Koetsier, JL, Hegazy, M. & Green, KJ Desmosomen polarisieren und integrieren chemische und mechanische Signale, um die Form und Funktion des epidermalen Gewebes zu steuern. Curr. Biol. 31, 3275-3291.e3275. https://doi.org/10.1016/j.cub.2021.05.021 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sumigray, K., Zhou, K. & Lechler, T. Zell-Zell-Adhäsionen und Zellkontraktilität werden bei Desmosomstörung hochreguliert. PLoS ONE 9, e101824. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101824 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fiore, VF et al. Die Mechanik eines mehrschichtigen Epithels bestimmt die Architektur und Funktion des Tumors. Natur 585, 433–439. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2695-9 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huber, KL et al. HYVIA™: Ein neuartiger, topischer Chiasamenextrakt, der die Hautfeuchtigkeit verbessert. J. Kosmetik. Dermatol. 19, 2386–2393. https://doi.org/10.1111/jocd.13469 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Favre, B., Begré, N. & Borradori, L. Eine rezessive Mutation im DSP-Gen, die mit Kardiomyopathie, Hautbrüchigkeit und Haardefekten verbunden ist, beeinträchtigt die Bindung von Desmoplakin an epidermale Keratine und das muskelspezifische Zwischenfilament Desmin. Br. J. Dermatol. 179, 797–799. https://doi.org/10.1111/bjd.16832 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Castelletti, S. et al. Desmoplakin-Missense- und Nicht-Missense-Mutationen bei arrhythmogener rechtsventrikulärer Kardiomyopathie: Genotyp-Phänotyp-Korrelation. Int. J. Cardiol. 249, 268–273. https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2017.05.018 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Dehner, C., Rotzer, V., Waschke, J. & Spindler, V. Eine Desmoplakin-Punktmutation mit verstärkter Keratin-Assoziation lindert den durch Pemphigus vulgaris verursachten Autoantikörper-vermittelten Verlust der Zellkohäsion. Bin. J. Pathol. 184, 2528–2536. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2014.05.016 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bouameur, JE et al. Die Phosphorylierung von Serin 4.642 im C-Terminus von Plektin durch MNK2 und PKA moduliert seine Wechselwirkung mit Zwischenfilamenten. J. Cell Sci. 126, 4195–4207. https://doi.org/10.1242/jcs.127779 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arnette, C., Koetsier, JL, Hoover, P., Getsios, S. & Green, KJ In-vitro-Modell der Epidermis: Verknüpfung der Proteinfunktion mit der 3D-Struktur. Methoden Enzymol. 569, 287–308. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2015.07.015 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Angst, BD, Nilles, LA & Green, KJ Die Expression von Desmoplakin II ist nicht auf geschichtete Epithelien beschränkt. J. Cell Sci. 97 (Teil 2), 247–257. https://doi.org/10.1242/jcs.97.2.247 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bornslaeger, EA, Corcoran, CM, Stappenbeck, TS & Green, KJ Die Verbindung aufbrechen: Die Verdrängung des desmosomalen Plaque-Proteins Desmoplakin von Zell-Zell-Grenzflächen unterbricht die Verankerung interzellulärer Filamentbündel und verändert den Aufbau interzellulärer Verbindungen. J. Cell Biol. 134, 985–1001. https://doi.org/10.1083/jcb.134.4.985 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Parrish, EP, Steart, PV, Garrod, DR & Weller, RO Antidesmosomaler monoklonaler Antikörper bei der Diagnose intrakranieller Tumoren. J. Pathol. 153, 265–273. https://doi.org/10.1002/path.1711530311 (1987).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hudson, TY et al. In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Desmoplakin und Zwischenfilamenten und ihrer Rolle bei der Haftfestigkeit. Methoden Zellbiol. 78, 757–786. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(04)78026-7 (2004).

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Wir danken den Mitgliedern des Green Lab für ihr wertvolles Feedback und ihre Diskussion. Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnisse wurden vom Northwestern University Skin Biology & Diseases Resource-Based Center der National Institutes of Health unter der Fördernummer P30AR075049 unterstützt. Die Bildgebungsarbeiten wurden am Northwestern University Center for Advanced Microscopy durchgeführt, großzügig unterstützt durch NCI CCSG P30 CA060553, vergeben an das Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. Die Pathology Core Facility (PCF) und das Mouse Histology and Phenotyping Laboratory (MHPL) der Northwestern University führten Schnitte menschlicher Hautproben durch und rekonstruierten 3D-Hautäquivalente. Diese Arbeit wurde von NIH R01 AR43380, NIAMS R01 AR041836 und NCI R01 CA228196 an KJG unterstützt. ALP wurde von T32AR060710 und F32AR081677 unterstützt.

Abteilung für Pathologie, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 303 E Chicago Ave., Chicago, IL, 60611, USA

Abbey L. Perl, Jennifer L. Koetsier und Kathleen J. Green

Abteilung für Dermatologie, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, Chicago, IL, USA

Kathleen J. Green

Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University, Chicago, IL, USA

Kathleen J. Green

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Konzeptualisierung ALP und KJG; Methodik ALP und JLK; Schreiben von ALP und KJG; Visualisierung ALP; Finanzierungseinwerbung ALP und KJG

Korrespondenz mit Kathleen J. Green.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Perl, AL, Koetsier, JL & Green, KJ PP2A-B55alpha kontrolliert die Keratinozytenadhäsion durch Dephosphorylierung des Desmoplakin-C-Terminus. Sci Rep 13, 12720 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37874-8

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Eingegangen: 07. November 2022

Angenommen: 28. Juni 2023

Veröffentlicht: 05. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37874-8

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