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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11652 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Genombearbeitung mit CRISPR ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Aufklärung biologischer Funktionen. Um das Genom wie beabsichtigt zu verändern, ist es wichtig, die verschiedenen Arten der Rekombination zu verstehen, die auftreten können. In dieser Studie berichten wir über komplexe Vektorinsertionen, die während der Generierung bedingter Allele durch CRISPR-Bearbeitung mithilfe der Mikrohomologie-vermittelten Endverbindung (MMEJ) identifiziert wurden. Der Targeting-Vektor enthielt zwei loxP-Sequenzen und flankierende 40-bp-Mikrohomologien. Die den loxP-Sequenzen entsprechenden genomischen Regionen wurden mit Cas9 in embryonalen Stammzellen der Maus gespalten. Das PCR-Screening auf gezielte Rekombination ergab eine hohe Häufigkeit von Banden, die größer als erwartet waren. Die Nanoporensequenzierung dieser Banden ergab komplexe Vektorinsertionen, die nicht nur durch MMEJ, sondern auch durch nicht-homologe Endverknüpfung und homologe Rekombination in mindestens 17 % der Klone vermittelt wurden. Bei der Verbesserung der PCR-Bedingungen erschien eine neue Bande, was auf das Vorhandensein unbeabsichtigt veränderter Allele schließen lässt, die dem Standard-PCR-Screening entgehen. Dies veranlasste uns, die Rekombination jedes Allels der genomeditierten Klone mithilfe heterozygoter Einzelnukleotidpolymorphismen zu charakterisieren, was zur Bestätigung des Vorhandenseins homozygoter Allele führte. Unsere Studie zeigt, dass eine sorgfältige Qualitätskontrolle genomeditierter Klone erforderlich ist, um eine komplexe, unbeabsichtigte Vektorinsertion am Ziel auszuschließen.

In den letzten Jahren hat die Technologie zur Genommodifikation mit der Einführung des CRISPR-Systems große Fortschritte gemacht1. Es ist jedoch immer möglich, dass es bei der CRISPR-Genombearbeitung zu einer unbeabsichtigten Rekombination kommt. Daher ist die Qualitätskontrolle genomeditierter Klone wichtig, um sicherzustellen, dass die beabsichtigte Rekombination in den Klonen nicht von einer unbeabsichtigten Rekombination begleitet wird. Eine unbeabsichtigte Rekombination kann am Zielort der Rekombination oder in vom Zielort entfernten Genomregionen auftreten. Die letztere Art der Rekombination tritt aufgrund der teilweisen Anlagerung von Guide-RNAs (gRNAs) häufig in Genomsequenzen auf, die der Zielsequenz ähneln. Eine solche Rekombination wird als „Off-Target“-Effekt bezeichnet und es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um sie nachzuweisen2,3. Was die frühere unbeabsichtigte Rekombination „am Ziel“ betrifft, wurden große Deletionen an der gesamten Zielstelle gemeldet4,5,6,7. Typischerweise werden die interessierenden Rekombinanten mittels PCR gescreent. Daher können große genomische Deletionen, die mit dem Verlust von PCR-Primer-Bindungsstellen einhergehen, unbemerkt bleiben. Kürzlich wurde über andere Arten der unbeabsichtigten Rekombination am Ziel berichtet, bei denen gRNA-Vektoren oder mitochondriale DNA an der genomischen Spaltungsstelle des Ziels eingefügt werden8. Obwohl die PCR-Primer-Bindungsstellen in diesen Fällen erhalten blieben, blieb die Insertion der unbeabsichtigten exogenen Sequenz beim anfänglichen PCR-Screening unbemerkt, da die Größe des PCR-Amplifikats über der Nachweisgrenze lag. Eine solche unbeabsichtigte On-Target-Rekombination muss sorgfältig untersucht werden, insbesondere wenn eine biallelische Genombearbeitung beabsichtigt ist, da der Verlust des Wildtyp-(wt)-Allels, wie durch PCR-Analyse verifiziert, möglicherweise nicht durch homozygote Genombearbeitung, sondern durch die Kombination der beabsichtigten verursacht wird Rekombination in einem Allel und unbeabsichtigte Rekombination im anderen Allel.

In der vorliegenden Studie berichten wir über unbeabsichtigte, komplexe, zielgerichtete Vektorinsertionsmuster, die wir im Prozess der Generierung bedingter Allele für das Cre/loxP-System in kultivierten Zellen identifiziert haben. Um ein bedingtes Allel zu erzeugen, müssen zwei loxP-Sequenzen eingefügt werden, eine stromaufwärts und die andere stromabwärts der Zielgenomregion. Darüber hinaus müssen beide Allele auf die gleiche Weise modifiziert werden, um eine phänotypische Analyse in kultivierten Zellen durchzuführen. Somit müssen insgesamt vier loxP-Stellen in das Genom eingefügt werden. Verschiedene Reparaturwege, nämlich homologe Rekombination (HR), nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und mikrohomologievermittelte Endverknüpfung (MMEJ), können eingesetzt werden, um Fremdsequenzen in das Genom einzuführen. HR ist der am weitesten verbreitete Weg und erfordert einen Homologiearm von 500–1000 bp im Targeting-Vektor9. Es wird berichtet, dass der HR-Weg hauptsächlich von der späten S- bis zur G2-Phase des Zellzyklus aktiv ist10. Im Gegensatz dazu ist der NHEJ-Weg während des gesamten Zellzyklus aktiv10. Daher ermöglicht die NHEJ-basierte Methode eine gezielte Insertion in Zelltypen, bei denen die HR-Methode ineffizient ist, wie z. B. Neuronen, obwohl die Verbindungssequenz an der Rekombinationsstelle im Vergleich zu der in HR11 schwer zu kontrollieren ist. In jüngerer Zeit wurde eine Methode namens PITCh-System (Precise Integration into Target Chromosome) unter Verwendung von MMEJ entwickelt12,13. Bei dieser Methode werden für die Rekombination Mikrohomologiearme mit einer Länge von nur 10–40 Basen verwendet. Es wird berichtet, dass der MMEJ-Weg hauptsächlich von der M- bis zur frühen S-Phase14 aktiv ist, was im Vergleich zum HR einen anderen Rekombinationsmodus ermöglicht. Wir haben in der vorliegenden Studie die PITCh-Methode verwendet, da die Insertion der 34 Basen langen loxP-Sequenz in das Genom aufgrund der kurzen Länge des Homologiearms des Targeting-Vektors leicht durch PCR nachgewiesen werden kann. Das PCR-Screening ergab jedoch bei hoher Häufigkeit Banden mit unbeabsichtigter Größe, die länger als erwartet waren. Die Analyse dieser Banden mit Nanopore-Long-Read-Sequenzierung ergab komplexe Vektorinsertionen, an denen nicht nur MMEJ, sondern auch HR und NHEJ beteiligt waren. Die Größe der eingefügten Vektorsequenz könnte über der Nachweisgrenze der standardmäßigen PCR-basierten Qualitätskontrollmethode für genomeditierte Klone liegen. Wir schlagen vor, dass die in dieser Studie festgestellte unbeabsichtigte On-Target-Rekombination in der Qualitätskontrollphase der Genombearbeitung sorgfältig ausgeschlossen werden muss.

Abbildung 1A zeigt einen Überblick über das MMEJ-vermittelte Genombearbeitungssystem PITCh12,13. Die vollständige Sequenz des Targeting-Vektors ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die PITCh-Methode kann entsprechend der Anzahl der Schnittstellen im Genom und dem Targeting-Vektor in drei Typen eingeteilt werden. Das Schneiden des Genoms und des Targeting-Vektors an einer Stelle ist unkompliziert, aber das Plasmid-Rückgrat des Targeting-Vektors wird in das Genom eingebaut (Abb. 1A, links). Das Schneiden an einer Stelle im Genom und an zwei Stellen im Targeting-Vektor verhindert den Einbau des Plasmidrückgrats in das Genom (Abb. 1A, Mitte). In der vorliegenden Studie haben wir an zwei Stellen sowohl im Genom als auch im Targeting-Vektor geschnitten (Abb. 1A, rechts). Diese Strategie ermöglicht die Einfügung exogener Sequenzen an jeder Schnittstelle im Genom.

Überblick über die MMEJ-vermittelte Targeting-Strategie. (A) Das MMEJ-vermittelte Genom-Editierungssystem PITCh, klassifiziert nach der Anzahl der Schnittstellen im Genom und dem Targeting-Vektor. Dicke rote und blaue Linien, Mikrohomologien; gelbes Kästchen, exogene Sequenz. (B) Erzeugung des bedingten Allels am Maus-Klf2-Locus. E-Exon, 5′mH 5′-Mikrohomologie, 3′mH 3′-Mikrohomologie, PGK-Phosphoglyceratkinase-1-Promotor, Neo-Neomycin-Resistenzgen, pA-Polyadenylierungssignal. (C) Gelöschtes Allel, das erzeugt wurde, als der Targeting-Vektor nicht an der Rekombination beteiligt war. Die Größe jedes Elements ist aus Platzgründen nicht maßstabsgetreu.

Abbildung 1B veranschaulicht die Strategie, die bei der Erstellung des bedingten Allels für das Cre/loxP-System mithilfe der PITCh-Methode angewendet wird. Wir planten, Exon 2 des Maus-Klf2-Gens mithilfe des Cre/loxP-Systems in embryonalen Stammzellen (ESCs) der Maus zu löschen. Wir exprimierten gRNAs als Single-Guide-RNAs (sgRNAs) unter Verwendung des Cas9/gRNA-Expressionsvektors pX33015. LoxP-Stellen wurden genau an den Schnittstellen des Cas9/gRNA-Komplexes in den Targeting-Vektor eingefügt. Vierzig Basenpaare von Mikrohomologien wurden stromaufwärts und stromabwärts der loxP-Stellen im Targeting-Vektor platziert. Die gRNA-Zielstelle, die im Originalbericht zum PITCh-System12 beschrieben ist, wurde außerhalb der Mikrohomologien des Targeting-Vektors eingefügt (ergänzende Abbildung 1). Der Targeting-Vektor enthielt die Kassette des Neomycin-Resistenzgens (neo), um die gezielten Ereignisse durch G418-Selektion anzureichern.

Maus-ESCs wurden mit dem Targeting-Vektor und den drei gRNAs transfiziert (Abb. 1B). Eine erfolgreiche Spaltung der gRNA-Zielstellen würde Mikrohomologien im Genom und im Targeting-Vektor freilegen, die für die MMEJ-unterstützte Rekombination verwendet würden. Zielklone wurden mittels PCR gescreent, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Die Neo-Kassette konnte durch das Flp/FRT-System nach der Isolierung der Zielklone herausgeschnitten werden. Die gesamte Region von Exon 2 zwischen den beiden gRNA-Zielstellen könnte durch NHEJ gelöscht werden, falls der Targeting-Vektor nicht an der Rekombination beteiligt wäre (Abb. 1C).

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse des PCR-Screenings für die Zielklone. Das Primerpaar I erkennt die Upstream-Rekombination: Vom wt-Allel wird eine 288-bp-Bande und von der erwarteten Rekombination eine 322-bp-Bande erwartet (Abb. 2A). Das Primerpaar II verstärkt die Zielstellen, die sich über die Vektorinsertion erstrecken: Eine 1385-bp-Bande wird vom wt-Allel erwartet, eine 3001-bp-Bande von der vorhergesagten Rekombination und eine 324-bp-Bande von der Deletion zwischen den beiden Spaltungsstellen (Abb . 2A). Das Primerpaar III erkennt die Downstream-Rekombination: Von der beabsichtigten Rekombination wird eine 314-bp-Bande erwartet (Abb. 2A).

PCR-Screening für gezielte Klone. (A) Genomstruktur der Wildtyp-, Ziel- und gelöschten Allele. Schwarze Pfeilspitzen zeigen PCR-Primer an. Andere Abkürzungen sind die gleichen wie in Abb. 1B. (B) Ergebnisse des PCR-Screenings. Die Ergebnisse in den Feldern I, II und III wurden unter Verwendung der in (A) gezeigten PCR-Primerpaare I, II und III erhalten. Bänder, die nahe an der erwarteten Größe liegen, werden durch Sternchen und Bänder, die länger als erwartet sind, durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Mit Pfeilen markierte Klone wurden erneut geklont und analysiert, wie in (C) gezeigt. M DNA-Größenmarker. (C) PCR-Analyse nach erneutem Klonen. Von Rechtecken umgebene Banden wurden gereinigt und durch Long-Read-Sequenzierung weiter analysiert. Die Originalgele von (B) und (C) sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 4 bzw. 5.

Wir haben insgesamt 48 Klone gescreent (Abb. 2B). Bei einigen Klonen mit dem Primerpaar II wurde eine Bande von etwa 0,3 kb beobachtet, was auf eine Deletion zwischen den beiden Schnittstellen hinweist (Abb. 2A). Unter Verwendung der Primerpaare I, II und III wurden die vom Zielallel erwarteten Banden in 15, 11 bzw. 25 Klonen nachgewiesen (in Abb. 2B durch Sternchen gekennzeichnet). Allerdings zeigten nur fünf Klone die erwarteten Banden mit allen Primerpaaren (Klone 5, 15, 28, 29 und 39 in Abb. 2B), was darauf hindeutet, dass häufig unbeabsichtigte Vektorinsertionsmuster auftraten. Bei 21 Klonen wurden länger als erwartete Banden (dargestellt durch Pfeilspitzen in Abb. 2B) beobachtet, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass das Vektorinsertionsmuster anders war als erwartet. Theoretisch kann eine mit Primerpaar III nachgewiesene Insertion mit Primerpaar II nachgewiesen werden, wenn der Upstream-Primer vorhanden ist und die Amplifikationseffizienz ausreichend ist. Allerdings zeigten von den 14 Klonen, die mit dem Primerpaar III länger als erwartete Banden zeigten, nur zwei Klone (Klone 21 und 24) eine entsprechende Amplifikation mit dem Primerpaar II, was darauf hindeutet, dass die meisten Vektorinsertionen nicht nachweisbar waren Grenze mit Primerpaar II.

Basierend auf diesen Ergebnissen kamen wir zu dem Schluss, dass die Art der unvorhergesehenen Vektorinsertionen geklärt werden muss, um die Qualität der genomeditierten Klone genau beurteilen zu können. Um Hinweise auf den Mechanismus der unvorhergesehenen Rekombination zu erhalten, wollten wir die Sequenz der gesamten Region der Vektorinsertionen bestimmen. Wir haben die folgenden Klone ausgewählt, die in Abb. 2B durch Pfeile gekennzeichnet sind: Erstens Klone, die für mindestens eines der Primerpaare eine größere Bandengröße als erwartet zeigten (Klone 6, 21, 24, 31, 37 und 45). und zweitens Klone ohne PCR-Amplifikation außer dem Vorhandensein einer Bande in wt-Größe für das Primerpaar II, obwohl die Amplifikation für eines der Primerpaare I oder III stark darauf hindeutet, dass die Vektorinsertion an der Zielstelle erfolgte (Klone 20, 23, 27, und 44). Drittens haben wir zwei Klone eingeschlossen, die die erwartete Bandengröße für alle Primerpaare zeigen (Klone 29 und 39). Klon 39 zeigte eine sehr starke 3-kb-Bande für das Primerpaar II, begleitet von einer sehr schwachen 1,4-kb-Wt-Bande, was darauf hindeutet, dass eine biallelische Rekombination stattfand, aber eine kleine Anzahl von wt-Allel enthaltenden Zellen kontaminiert war. Im Gegensatz dazu zeigte Klon 29 zusätzlich zur erwarteten 3-kb-Bande eine nicht zu vernachlässigende Amplifikation einer 1,4 kb großen Bande in wt-Größe für Primerpaar II. Klon 29 zeigte auch zwei Banden mit unterschiedlicher Intensität für die Primerpaare I und III, was stark auf die Möglichkeit hindeutet, dass zwei Klone während der Koloniebildung von G418-resistenten ESCs fusioniert wurden. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass ein erneutes Klonen erforderlich ist, um das Rekombinationsereignis genau zu analysieren.

Daher führten wir das erneute Klonen jedes Klons durch, indem wir Zellen spärlich in Kulturschalen ausplattierten und für jeden Klon zwei aus Einzelzellen stammende Kolonien isolierten (Abb. 2C). Für die PCR-Analyse in Abb. 2B wurden Zelllysate als Vorlagen verwendet, um ein schnelles Screening zu ermöglichen (Einzelheiten zum Verfahren siehe „Methoden“). Um andererseits die Nachweisempfindlichkeit der PCR zu erhöhen, wurde die genomische DNA der erneut geklonten Zellen durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung in hoher Reinheit aufbereitet. Darüber hinaus wurde die Elongationszeit von 3 Minuten (Abb. 2B) auf 8 Minuten (Abb. 2C) verlängert, sodass lange Insertionssequenzen amplifiziert werden konnten. In einigen Fällen zeigte nur einer der Subklone eine Bande oder beide Subklone zeigten keine Banden (Abb. 2C), was darauf hindeutet, dass mehr als ein Klon vor dem erneuten Klonen gemischt wurde. Die in Abb. 2B beobachtete 1,4 kb große Bande in wt-Größe verschwand für Klon 29, was darauf hindeutet, dass dieser Klon möglicherweise die erwartete Vektorinsertion in beiden Allelen aufwies. Wichtig ist, dass wir in Klon 44 eine neue Bande beobachteten, die größer als vorhergesagt war (Abb. 2C) und im ersten PCR-Screening nicht sichtbar war (Abb. 2B). Dieses Ergebnis zeigt, dass ein unbeabsichtigtes Vektorinsertionsmuster der Erkennung durch das Standard-PCR-Screeningverfahren entgehen kann.

Abbildung 3A veranschaulicht die Sequenzierungsstrategie. Zunächst wurde die PCR-Bande in ein Plasmid kloniert. Da die PCR-Bande größer als erwartet war, ist es möglich, dass Wiederholungssequenzen in den PCR-Produkten vorhanden waren, beispielsweise die Insertion von zwei Vektorkopien. Daher haben wir den Long-Read-Sequenzer MinION verwendet, der sich wiederholende Sequenzen analysieren kann. Die Konsensussequenzen der Lesesequenzen wurden mit dem Assembliertool Flye16 erhalten (ergänzende Abbildung 2). Das Insertionsmuster des Vektors wurde dann durch Vergleich der Konsensussequenzen mit den Vektor- und Genomsequenzen geschätzt. Bei der MinION-Sequenzierung treten Nukleotidsequenzfehler häufig auf, sodass bei der Interpretation der Konsensussequenz Vorsicht geboten ist. Daher wurden die Sequenzen der Rekombinationsverbindungen zwischen dem Genom und dem Vektor oder zwischen zwei Vektoren, die von MinION geschätzt wurden, auch durch direkte Sanger-Sequenzierung der in Abb. 2C gezeigten PCR-Produkte bestimmt. Alle Zielsequenzen der gRNAs wurden ebenfalls nach der Sanger-Methode bestimmt. Selbst wenn eine gRNA-Zielstelle nicht an der Rekombination mit dem Targeting-Vektor beteiligt war, wie später gezeigt wird, zeigte das Vorhandensein der Mutation an der gRNA-Zielstelle, dass die Zielsequenz durch den Cas9/gRNA-Komplex gespalten wurde.

Long-Read-Sequenzanalyse der Vektorinsertion. (A) Überblick über die Long-Read-Sequenzanalyse. (B) Beispiel für die Annotation einer Konsenssequenz, die durch De-novo-Assemblierung von Long-Read-Sequenzierungsdaten erhalten wurde. Es werden auch Beispiele für die direkte Sequenzierung mit der Sanger-Methode gezeigt, die durchgeführt wurde, um die Genauigkeit der Baugruppe zu bestätigen. (C) Anmerkung zu den Ergebnissen der Sanger-Sequenzierung in den in (B) gezeigten Regionen I, II und III.

Abbildung 3B,C zeigt ein Beispiel für die Analyse von Klon 37 (Abb. 2C), und das aus dieser Analyse abgeleitete Rekombinationsmuster ist in Abb. 4F dargestellt. In diesem Beispiel wurden zwei Vektoren durch NHEJ verknüpft und in das Genom eingefügt. An der Vektorbindungsstelle wurde in einem der Vektoren eine etwa 1,2 kb große Sequenz gelöscht (Abb. 3B, C). Der verknüpfte Vektor wurde durch HR zwischen Exon-2-Sequenzen in der Upstream-Region und durch das ursprünglich vorgesehene MMEJ in der Downstream-Region in das Genom eingefügt (Abb. 3B, C, 4F). Obwohl die stromaufwärts gelegene gRNA-Zielstelle nicht an der Rekombination mit dem Vektor beteiligt war, wurde an dieser Stelle durch Sanger-Sequenzierung eine Mutation nachgewiesen (Abb. 3B, C), was bestätigt, dass eine Spaltung stattgefunden hat.

Aus Long-Read-Sequenzierung abgeleitete Rekombinationsmuster. Jedes Rekombinationsmuster wurde auf der Grundlage der in Abb. 3B, C für Klon 37 und der ergänzenden Abb. 3 für andere Klone gezeigten Ergebnisse abgeleitet.

Die gleiche Analyse wie in Abb. 3B, C wurde für alle Klone durchgeführt, wie in der ergänzenden Abb. 3 detailliert beschrieben. Die aus der Analyse abgeleiteten Rekombinationsmuster sind in Abb. 4 dargestellt. In vielen Fällen ist nur eine Spaltstelle des Genoms oder Der Vektor war an der Rekombination beteiligt (Klone 6, 21, 24, 27, 31, 37, 44 und 45). Da ein Mikrohomologiepaar des Genoms und des Vektors durch einen Doppelstrangbruch freigelegt werden muss, damit MMEJ auftritt (Abb. 1), konnte MMEJ in diesen Klonen weder im Upstream- noch im Downstream-Bereich auftreten. Stattdessen wurde in solchen Regionen NHEJ oder HR beobachtet. Dadurch entstehen unterschiedliche Kombinationen von Reparaturwegen, nämlich NHEJ und MMEJ (Klone 6, 31, 44 und 45 in Abb. 4), HR und MMEJ (Klon 27 in Abb. 4), HR und NHEJ (Klon 24). in Abb. 4) und HR, NHEJ und MMEJ (Klon 37 in Abb. 4) waren an Vektorinsertionen beteiligt. In einem Fall trat NHEJ und nicht MMEJ auf, obwohl an der Spaltungsstelle Mikrohomologie vorhanden gewesen sein muss (Klon 21).

Wie oben gezeigt, führt die Rekombination an nur einer Spaltungsstelle im Genom oder im Vektor zum Einfügen einer unbeabsichtigten Sequenz in das Genom. Dies erwies sich als einer der Gründe für das Vorhandensein unbeabsichtigter PCR-Banden, die größer als erwartet waren. Wenn nur eine Spaltstelle im Vektor für die Rekombination verwendet wird, wird die Größe der PCR-Bande aufgrund der Insertion des 2,7-kb-Vektorrückgrats in das Genom erheblich größer (Klone 6, 24, 31 und 44 in Abb. 4). . Wenn außerdem nur eine Spaltstelle an der Rekombination sowohl im Genom als auch im Vektor beteiligt ist, wie im Fall von Klon 44 (Abb. 4G), ist die Bande 3,8 kb länger als erwartet, was zu einer erheblichen Verringerung der Nachweisempfindlichkeit führt der PCR. Tatsächlich konnte die Vektorsequenz in voller Länge durch die anfängliche PCR für Klon 44 nicht amplifiziert werden (Abb. 2B) und wurde erst nach Erhöhung der PCR-Verlängerungszeit von 3 auf 8 Minuten und unter Verwendung einer hochgereinigten genomischen DNA-Matrize amplifiziert (Abb . 2C). Die Verknüpfung mehrerer Vektoren erhöht auch die Größe der Vektorinsertion erheblich, wie in Klon 37 beobachtet (Abb. 4F).

Interessanterweise war an der Integrationsstelle für Klon 27 kein Selektionsmarker vorhanden. Da alle Klone auf G418-Resistenz selektiert wurden, wurde wahrscheinlich eine weitere Kopie der Vektorsequenz in das Genom eingefügt. Um diese Annahme zu untermauern, erkannte das Primerpaar III eine Bande, die etwas größer als die erwartete Größe war (Abb. 2B), was auf eine Vektorinsertion in das andere Allel durch NHEJ hinweist. Es wurde festgestellt, dass die beiden Klone, die die erwarteten PCR-Banden für alle Primerpaare zeigten, wie erwartet eine MMEJ-vermittelte Rekombination durchlaufen hatten (Klone 29 und 39).

Insgesamt wurde durch eine Long-Read-Sequenzanalyse festgestellt, dass acht Klone unbeabsichtigte Rekombinationsmuster aufwiesen. Da zunächst 48 Klone mittels PCR gescreent wurden, betrug die Häufigkeit unbeabsichtigter Rekombinationsmuster 17 % (acht von 48). Wir halten diese Häufigkeit für eine Unterschätzung, da 11 weitere Klone länger als erwartete PCR-Banden zeigten (Abb. 2B), aber nicht im Detail analysiert wurden (siehe „Diskussion“).

Die oben gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine unbeabsichtigte Rekombination Allele erzeugen kann, die der Erkennung durch PCR entgehen können. Dies ist besonders wichtig, wenn eine homozygote Genommodifikation angestrebt wird, was das ursprüngliche Ziel dieser Studie war. Die Klone 29 und 39 waren Kandidaten für eine homozygote Genommodifikation, da die erwartete MMEJ-induzierte Rekombination durch Sequenzanalyse nachgewiesen wurde (Abb. 4E) und durch PCR nach dem erneuten Klonen keine wt-Allele nachgewiesen wurden (Abb. 2C). Es besteht jedoch weiterhin die Möglichkeit, dass die MMEJ-vermittelte Rekombination nur in einem Allel auftrat, während in das andere Allel eine große, durch PCR nicht nachweisbare Sequenz eingefügt wurde. Um diese Möglichkeit auszuschließen, haben wir das PCR-Screening neu gestaltet. Ein Primerpaar wurde eingerichtet, um heterozygote SNPs stromaufwärts und stromabwärts der Zielstelle zu amplifizieren (Abb. 5A). Mit diesem Primerpaar haben wir die Klone 29 und 39 erneut analysiert und wie erwartet eine einzelne Bande erhalten (Abb. 5B, links). Die Sequenzierung beider Enden dieser Bande ergab das Vorhandensein heterozygoter SNPs (Abb. 5B, rechts). Dies bestätigte, dass die vorhergesagte Rekombination in beiden Allelen dieser Klone auftrat. Um die Funktionalität der loxP-Stellen zu überprüfen, wurde Klon 39 4-Hydroxytamoxifen (4HT) ausgesetzt, um die Cre-Rekombinase-Aktivität zu induzieren (Abb. 6A). Das PCR-Ergebnis stimmte mit der Rekombination zwischen loxP-Stellen überein (Abb. 6B). Darüber hinaus zeigten 4HT-behandelte ESCs eine Empfindlichkeit gegenüber G418 (Abb. 6C), was auf eine erfolgreiche Löschung der Neo-Expressionskassette durch Rekombination zwischen loxP-Stellen hinweist. Diese Ergebnisse belegen die Funktionalität der durch MMEJ-vermittelte Rekombination eingeführten loxP-Stellen.

Allelanalyse der Rekombination unter Verwendung heterozygoter SNPs. (A) Struktur des Ziel-Allels der Klone 29 und 39. Die Positionen der heterozygoten SNPs zur Unterscheidung der C57BL/6J- und 129S6/SvEvTac-Allele werden durch die genomischen Koordinaten der mm10-Genomassemblierung angezeigt. (B) PCR-Produkt der Insertionssequenz voller Länge (links) und SNP-Analyse durch Sanger-Sequenzierung (rechts). Bei allen SNPs wurde Heterozygotie festgestellt, was auf homozygot gezielte Ereignisse hinweist. M, DNA-Größenmarker. Das Originalgel ist in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt.

4HT-induzierte Cre/loxP-vermittelte Rekombination im biallelisch modifizierten ESC-Klon. (A) Genomstruktur der Wildtyp-, Ziel- und rekombinierten Allele. In diesem Experiment wurde Klon 39 verwendet, von dem in Abb. 5 gezeigt wurde, dass er biallelische Modifikationen aufweist. Die parentale ESC-Linie enthält die ERT2-iCre-ERT2-Kassette am Rosa26-Locus, und die 4HT-Behandlung induziert die Rekombinaseaktivität von Cre. Schwarze Pfeilspitzen zeigen PCR-Primer an. Andere Abkürzungen sind die gleichen wie in Abb. 1B. (B) Ergebnisse des PCR-Screenings. Die Ergebnisse in Panel I und II wurden unter Verwendung der in (A) gezeigten PCR-Primerpaare I und II erhalten. M, DNA-Größenmarker. Die Originalgele sind in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. (C) G418-Empfindlichkeit von ESCs nach 4HT-Behandlung. − 4HT ohne 4HT, + 4HT mit 4HT. Maßstabsbalken, 500 µm.

Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei der Genomeditierung lange exogene Sequenzen, die der Erkennung durch herkömmliches PCR-Screening entgehen, an der Zielstelle eingefügt werden können. Es ist wichtig, den Mechanismus aufzuklären, der einer solchen komplexen Rekombination zugrunde liegt, um genomeditierte Klone genau beurteilen zu können. Beispielsweise kann der Verlust des wt-Allels durch PCR als homozygot gezieltes Ereignis fehlinterpretiert werden und nicht auf die Insertion langer exogener Sequenzen jenseits der Nachweisgrenze der PCR zurückgeführt werden. Um Hinweise für die Charakterisierung solch komplexer Rekombinationsereignisse zu erhalten, analysierten wir Klone, die Insertionen langer exogener Sequenzen enthielten, mithilfe der Nanopore-Long-Read-Sequenzierungstechnologie. Die Analysen zeigten die Beteiligung unbeabsichtigter Reparaturwege wie NHEJ und HR an der Vektorinsertion, was zu einer Rekombination führte, die durch herkömmliches PCR-Screening möglicherweise schwer zu erkennen ist. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir die Bedeutung der Unterscheidung der Rekombination zwischen Allelen vermutet und die PCR-Analyse unter Verwendung heterozygoter SNPs neu gestaltet (Abb. 5).

Insgesamt haben wir die Sequenzen von Vektorinsertionen in voller Länge in acht Klonen von 48 durch PCR gescreenten Klonen bestimmt (Abb. 3, 4, ergänzende Abb. 2, 3). Daher wurde gezeigt, dass es sich bei 17 % der Einfügungen um unvorhergesehene Muster handelte, die nicht nur MMEJ, sondern auch NHEJ und HR betrafen. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Häufigkeit unterschätzt wird, da weitere 11 Klone im ersten PCR-Screening längere Banden als erwartet zeigten, aber nicht weiter analysiert wurden (Abb. 2B). Wenn wir diese 11 Klone einbeziehen, erreicht die Häufigkeit komplexer Rekombinationen 40 %. Diese Beobachtung legt den Schluss nahe, dass bei der Qualitätskontrolle genomeditierter Klone große Sorgfalt walten sollte.

Um bedingte Allele am Klf2-Genort der Maus zu erzeugen, verwendeten wir eine MMEJ-vermittelte Genombearbeitungsmethode namens PITCh. HR-vermittelte Methoden werden häufiger für die Insertion exogener Sequenzen verwendet. HR verwendet homologe Sequenzen von 500–1000 bp in den Targeting-Vektoren9, während MMEJ kurze homologe Sequenzen von 5 bis 40 bp12,13,17,18 verwendet. In der vorliegenden Studie wollten wir eine loxP-Sequenz von nur 34 bp einfügen. Daher hielten wir die PITCh-Methode mit ihrem kurzen Homologiearm für besser geeignet, um die Zunahme der Länge des PCR-Produkts nach der Rekombination nachzuweisen, als die HR-vermittelte Methode mit längeren Homologiearmen (Abb. 2B). Wir beobachteten jedoch eine hohe Häufigkeit unbeabsichtigter Rekombinationen. Ein möglicher Grund dafür ist, dass sowohl das Genom als auch der Vektor durch Cas9/gRNA an zwei Stellen gespalten werden mussten (Abb. 1B), in Wirklichkeit jedoch in kultivierten Zellen nicht gleichzeitig gespalten wurden. Unseres Wissens gibt es zwei Berichte über die MMEJ-basierte PITCh-Methode, bei der sowohl das Genom als auch der Vektor an zwei Stellen geschnitten wurden. In beiden Studien wurde die erwartete Rekombination häufiger beobachtet als in unserem Fall17,18. Allerdings wurden beide Experimente mit befruchteten Mäuseeiern durchgeführt. Alle gRNA-Zielstellen würden in befruchteten Eiern nahtlos gespalten, da ihnen hohe Konzentrationen an Cas9-gRNA-Ribonukleoproteinen (RNPs) und Targeting-Vektoren injiziert werden können. Daher ist ein direkter Vergleich mit der vorliegenden Studie, bei der kultivierte Zellen verwendet wurden, schwierig. In der vorliegenden Studie war in acht Klonen (Klone 6, 21, 24, 27, 31, 37, 44 und 45) nur eine gRNA-Zielstelle im Genom oder im Vektor an der Rekombination zwischen Genom und Vektor beteiligt Abb. 4). Alle nicht an der Rekombination beteiligten gRNA-Zielstellen waren in sechs von acht Klonen mutiert (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass eine gRNA-Spaltung stattgefunden hat. Möglicherweise wurden die gRNA-Zielstellen zu unterschiedlichen Zeiten gespalten und konnten daher nicht effizient für die MMEJ-vermittelte Rekombination genutzt werden. Die abgespaltenen Enden des Targeting-Vektors in PITCh würden zu einer NHEJ-vermittelten Vektorinsertion in das Genom führen, wenn die Mikrohomologie im Genom nicht durch einen Doppelstrangbruch freigelegt würde. Ein Kontrollexperiment mit einer einzelnen gRNA-Schnittstelle im genomischen Locus sowie dem Targeting-Vektor würde dabei helfen, die Ursache der unbeabsichtigten Rekombination zu identifizieren. Im Gegensatz dazu werden bei der herkömmlichen HR-basierten Genombearbeitung Zielvektoren in kreisförmiger Form verwendet, was die Häufigkeit der Vektoreinfügung über NHEJ verringern kann. Ein aktueller Bericht zeigte jedoch, dass während der Genombearbeitung mit CRISPR-Cas98 ein zirkulärer gRNA-Expressionsvektor und mitochondriale DNA in genomische Spaltstellen eingefügt wurden. Selbst wenn HR einen zirkulären Targeting-Vektor verwendet, könnte der Vektor daher auf unerwartete Weise in das Genom eingefügt werden. Eine Studie zeigte, dass die Linearisierung des Targeting-Vektors die Effizienz der HR-basierten Genombearbeitung verbessert19. Die Autoren stellten außerdem fest, dass NHEJ zwischen genomischen Spaltstellen und linearisierten Vektoren auftreten kann, bestimmten jedoch nicht die gesamte Insertionssequenz, wie dies in der vorliegenden Studie der Fall war. Basierend auf den Ergebnissen unserer Studie glauben wir, dass bei der Verwendung linearisierter Vektoren bei der HR-basierten Genombearbeitung ausreichend auf unbeabsichtigte Vektorinsertionen geachtet werden sollte, die durch PCR schwer zu erkennen sind.

Die PCR-Analyse nach dem erneuten Klonen zeigte eine erhöhte Verstärkung der unbeabsichtigten Banden oder das Auftreten neuer Banden, die vor dem erneuten Klonen nicht nachweisbar waren (Abb. 2C). Ein möglicher Grund dafür ist, dass die Verlängerungszeit von 3 auf 8 Minuten erhöht wurde. Ein weiterer Faktor könnte die Verwendung von genomischer DNA gewesen sein, die durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung hochgereinigt wurde, als PCR-Matrize nach dem erneuten Klonen, wohingegen Zelllysate vor dem erneuten Klonen als Matrize verwendet wurden. Wenn die eingefügte Sequenz jedoch extrem lang ist, würde die PCR-Amplifikation selbst unter verbesserten Bedingungen fehlschlagen. Beispielsweise könnten drei oder mehr Targeting-Vektoren verknüpft und in das Genom eingefügt werden, und eine solche Rekombination würde jenseits der Nachweisgrenze der PCR liegen. Wenn transgene Mäuse durch Mikroinjektion von Vektor-DNA in befruchtete Eier erzeugt werden, können tatsächlich Hunderte von Kopien tandemartig angeordneter Vektor-DNAs an bestimmten Stellen im Genom eingefügt werden20, und dasselbe kann in kultivierten Zellen passieren. Daher sollte bei der Beurteilung der Qualität genomeditierter Klone immer die Möglichkeit der Insertion langer exogener Sequenzen berücksichtigt werden, die die Nachweisgrenze der PCR überschreiten. In dieser Hinsicht wäre eine PCR-Analyse mit heterozygoten SNPs, wie in Abb. 5 dargestellt, nützlich. Allerdings werden heterozygote SNPs nicht immer in der Nähe der Zielstelle gefunden. In solchen Fällen wäre es sinnvoll, zwei Targeting-Vektoren mit unterschiedlichen Selektionsmarkern zu konstruieren und jedes Allel mit einem anderen Vektor zu modifizieren. Die Schätzung der Kopienzahl der inserierten Vektor-DNA durch Techniken wie quantitative PCR oder digitale Tröpfchen-PCR würde bei der Identifizierung von Kandidatenklonen mit biallelischer Vektorinsertion hilfreich sein. Darüber hinaus kann die PCR-Amplifikation des Vektorrückgrats hilfreich sein, um eine unbeabsichtigte Rekombination im Zusammenhang mit der Insertion des Vektorrückgrats und der zufälligen Insertion des Zielvektors außerhalb der Zielregion auszuschließen.

Wir haben eine Long-Read-Sequenzierung mit der Nanopore-Technologie durchgeführt, um ein vollständiges Bild der komplexen Rekombinationsmuster zu erhalten. Long-Read-Assembly ist effektiver als Short-Read-Assembly, wenn Wiederholungssequenzen vorhanden sind. Unsere Analyse ergab Fälle, in denen zwei Kopien der Vektoren verknüpft und in das Genom eingefügt wurden (Klon 37 in Abb. 4) oder zwei Kopien von Exon 2 nach der Rekombination vorhanden waren (Klone 21, 37, 44 und 45 in Abb. 4). ). Als das Rückgrat des Targeting-Vektors eingefügt wurde (Klone 6, 24, 31 und 44 in Abb. 4), kam es zu einer Sequenzüberlappung von etwa 3 kb zwischen dem klonierten Insert und dem Rückgrat der Klonierungsvektoren. Diese Rekombinationsereignisse wären mit Short-Read-Sequenzierung schwer zu analysieren gewesen. Andererseits weist die Long-Read-Sequenzierung den Nachteil einer geringen Sequenzgenauigkeit auf. Um diese Schwäche auszugleichen, führten wir eine direkte Sequenzierung der in Abb. 2C gezeigten PCR-Produkte durch und bestätigten die Nukleotidsequenzen der Rekombinationsverbindungen, die aus den Long-Read-Sequenzen vermutet wurden. Die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung stimmten in fast allen Fällen mit der aus der Long-Read-Sequenzierung abgeleiteten Konsenssequenz überein. Daher ist die Long-Read-Sequenzierungsanalyse eine leistungsstarke Strategie zur Analyse komplexer Rekombinationsmuster, bei denen davon ausgegangen wird, dass Wiederholungssequenzen vorhanden sind. Es ist zu beachten, dass unsere Long-Read-Sequenzierungsanalyse auf Vektorinsertionen ausgerichtet war, die durch PCR verstärkt werden konnten. Um eine unvoreingenommene Charakterisierung von Insertionsereignissen zu erreichen, würde ein gezielter Capture-Ansatz unter Verwendung von zur Vektorsequenz komplementären Oligonukleotiden, gefolgt von einer Long-Read-Sequenzierungsanalyse, wertvolle Informationen liefern. Dieser Ansatz würde es uns auch ermöglichen, das Erreichen einer biallelischen Insertion zu untersuchen, insbesondere wenn am Zielort keine SNPs in der Nähe vorhanden sind. Darüber hinaus würde es die Erkennung von Vektorinsertionen erleichtern, die weit von der Zielstelle entfernt liegen, und wertvolle Informationen zur Qualitätskontrolle für die Zielklone liefern.

Diese Studie zeigte, dass MMEJ, NHEJ und HR in verschiedenen Kombinationen an der Rekombination des Vektors und des Genoms beteiligt sind. Frühere Berichte haben gezeigt, dass NHEJ während des gesamten Zellzyklus auftritt, wohingegen MMEJ und HR hauptsächlich von der M- bis zur frühen S-Phase bzw. von der späten S- bis zur G2-Phase aktiv sind10,14. Daher gingen wir davon aus, dass HR und MMEJ wahrscheinlich nicht nebeneinander existieren würden. MMEJ und HR existierten jedoch gleichzeitig in zwei Rekombinanten, die durch Long-Read-Sequenzierung analysiert wurden (Klone 27 und 37 in Abb. 4). Dies deutet darauf hin, dass der Bereich der Zellzyklusphasen mit hoher MMEJ- und HR-Aktivität zumindest bei ESCs größer sein könnte als bisher angenommen. Alternativ ist es möglich, dass ein Rekombinationsereignis auftrat, gefolgt von einem anderen, nachdem der Zellzyklus fortgeschritten war. In dem Beispiel, in dem zwei Vektoren verknüpft und in das Genom eingefügt wurden, waren MMEJ, NHEJ und HR alle beteiligt (Klon 37 in Abb. 3B, C, 4F). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass verschiedene Wege flexibel genutzt werden, um Doppelstrangbrüche im Genom zu reparieren, was eine allgemeine Strategie für Organismen zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität sein könnte.

Um die gewünschte Rekombinante effizient zu erhalten, kann es sinnvoll sein, die Aktivität des beabsichtigten Rekombinationswegs zu erhöhen oder andere Rekombinationswege zu hemmen. Für die PITCh-Methode kann es nützlich sein, die Effizienz von MMEJ durch die erzwungene Expression eines MMEJ-Enhancers wie Exonuklease 118 oder durch die Verwendung von Inhibitoren von HR oder NHEJ21 zu steigern. Um MMEJ effizient zu induzieren, sollten alle gRNA-Zielstellen gleichzeitig gespalten werden, um Mikrohomologien für die Rekombination freizulegen. Zu diesem Zweck wurde zuvor vorgeschlagen, dieselbe gRNA zum Schneiden des Targeting-Vektors und des Genoms zu verwenden19. Alternativ könnte eine verbesserte Version von Cas922 oder gRNA23 wirksam sein. Die Verwendung von Cas9-gRNA-RNPs kann die Spaltung aller gRNA-Zielstellen innerhalb eines kürzeren Zeitrahmens im Vergleich zu Cas9 und von einem Plasmid exprimierter gRNA erleichtern. Es ist jedoch Vorsicht geboten, um eine Spaltung des Targeting-Vektors durch RNPs zu vermeiden, wenn diese vor der Transfektion kombiniert werden. Der Targeting-Vektor muss innerhalb der transfizierten Zellen gespalten werden, um einen effizienten Transfer der linearisierten Vektor-DNA in den MMEJ-Weg zu ermöglichen. Um Klone mit Insertion des Targeting-Vektor-Rückgrats in das Genom auszuschließen, platzieren Sie einen negativen Selektionsmarker wie das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen im Rückgrat und führen Sie eine negative Selektion mit Gancyclovir oder 1-2′-Desoxy-2′-fluor- durch. Beta-D-Arabinofuranosyl-5-ioduracil (FIAU) kann hilfreich sein24.

Insgesamt wird die in dieser Studie durchgeführte Charakterisierung unbeabsichtigter Rekombinanten Hinweise zur Verbesserung der Effizienz der Genombearbeitung und Qualitätskontrolle genomeditierter Klone liefern.

In dieser Studie wurde die GNL35REC4dn7-Maus-ESC-Linie (unveröffentlicht) verwendet, ein Derivat der KY1.1-Maus-ESC-Linie25. KY1.1 ist ein Hybrid aus den genetischen Hintergründen der Mäuse C57BL/6J und 129S6/SvEvTac; Daher können heterozygote SNPs zur Unterscheidung von Allelen verwendet werden. Die GNL35REC4dn7 ESC-Linie enthält das Nano-Laternen-Fluoreszenzprotein-Gen26 und die ERT2-iCre-ERT2-Kassette27 an den Loci Gm13227 und Rosa2828. Die genetischen Veränderungen am Gm13227-Locus sind für den Zweck der vorliegenden Studie irrelevant. Die ESCs wurden in KnockOut DMEM (Thermo Fisher Scientific; 10829018) kultiviert, ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS), nichtessentiellen Aminosäuren (Thermo Fisher Scientific; 11140050), 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 1000 U/ml Leukämie-Hemmfaktor ( LIF; Millipore; ESG1107), 1 µM des MEK-Inhibitors PD0325901 (Axon Medchem; 1408) und 3 µM des GSK3-Inhibitors CHIR99021 (Axon Medchem; 1386). Durch Zugabe von PD0325901 und CHIR99021, genannt 2i, zum Kulturmedium konnten ESCs in undifferenziertem Zustand in mit Gelatine beschichteten Schalen ohne Feederzellen kultiviert werden. Durch das Fehlen von Feederzellen konnte die Kontamination von Wildtierzellen in der PCR-Analyse vermieden werden. Um die Cre/loxP-Rekombination in biallelisch modifizierten ESC-Klonen zu bewerten, wurden ESCs dünn auf mit Gelatine beschichtete Vertiefungen in 2i-haltigem Kulturmedium mit oder ohne 1 µM 4HT ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die ESCs einer Selektion mit 250 µg/ml G418 unterzogen und ihre Empfindlichkeit gegenüber G418 wurde nach 6 Tagen Selektion bestimmt.

Sowohl Cas9 als auch gRNAs wurden mit dem pX330-Vektor15 exprimiert. Komplementäre Oligonukleotide, die der PITCh-gRNA, der Klf2-upstream-gRNA (gRNA-1) und der Klf2-downstream-gRNA (gRNA-2) entsprechen, wurden angelagert und in die BbsI-Stelle von pX330 kloniert, was zur Erzeugung von pX330-PITCh und pX330 führte -gRNA-1 bzw. pX330-gRNA-2. Die für die Vektorkonstruktion verwendeten Oligonukleotide sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Der Klf2-Targeting-Vektor wurde wie folgt unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Primer konstruiert und die vollständige Nukleotidsequenz des Targeting-Vektors ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. pPGKneo-F2F (Geschenk von Dr. K. Yusa) enthält das FRT-flankierte Die Neo-Selektionskassette wurde mit SacII und NotI neben der Neo-Kassette verdaut. Parallel dazu wurden genomische Fragmente des Maus-Klf2-Gens von der Promotorregion bis Intron 1 und von Intron 1 bis Intron 2 durch PCR unter Verwendung der Primerpaare Klf2-5HR-F1 und Klf2-5HR-R1 und Klf2-5HR-F2 amplifiziert Klf2-5HR-R2 bzw. Die 5′-Enden von Klf2-5HR-R1 und Klf2-5HR-F2 sind zueinander komplementär und enthalten die loxP-Sequenz. Die 5'-Enden von Klf2-5HR-F1 und Klf2-5HR-R2 sind komplementär zur pPGKneo-F2F-Vektorsequenz neben den SacII- bzw. NotI-Verdauungsstellen. Daher konnten die beiden PCR-Fragmente mithilfe des In-Fusion Cloning HD Kit (Takara; 639648) zusammengesetzt und in die SacII-NotI-Stelle von pPGKneo-F2F kloniert werden, was zur Erzeugung von pPGKneo-F2F-Klf2-5HR führte. Das genomische Klf2-Fragment von Intron 2 bis zur nicht translatierten Region von Exon 3 wurde synthetisiert (GenScript) und in die HindIII-SbfI-Stelle von pPGKneo-F2F-Klf2-5HR kloniert, die sich in Bezug auf die Neo-Kassette auf der gegenüberliegenden Seite der NotI-Stelle befindet. Dies führte zur Bildung von pPGKneo-F2F-Klf2-5HR-3HR-mod. Eine loxP-Stelle wurde in das synthetische Klf2-Fragment eingeführt, so dass sie sich neben der FRT-flankierten Neo-Kassette von pPGKneo-F2F-Klf2-5HR-3HR-mod befand. Um den PITCh-Targeting-Vektor zu erzeugen, wurde ein DNA-Fragment synthetisiert, das eine PITCh-gRNA-Zielstelle, eine 5‘-Mikrohomologiesequenz, eine loxP-Stelle, eine BglII- und AscI-Stelle, eine 3‘-Mikrohomologiesequenz und eine PITCh-gRNA-Zielstelle12 in dieser Reihenfolge enthielt, und kloniert in den pUC57-Vektor, was zur Erzeugung von pPITCh-bk führt. Das BglII-AscI-Fragment von pPGKneo-F2F-Klf2-5HR-3HR-mod, das das Klf2-Intron1-Intron-2-Fragment, die FRT-flankierte Neo-Kassette und eine loxP-Stelle enthielt, wurde in die BglII-AscI-Stelle von pPITCh-bk kloniert bei der Produktion des PITCh-Targeting-Vektors pKlf2-cKO-PITCh.

Am Tag 0 wurden ESCs (2,5 × 105) mit 1,25 µg pKlf2-cKO-PITCh, 0,42 µg jedes Cas9/gRNA-Vektors (pX330-PITCh, pX330-gRNA-1 und pX330-gRNA-2) gemischt 5 µl TransFast (Promega; E2431) in einem serumhaltigen Medium in einem Gesamtvolumen von 500 µl und in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte ausplattiert. Nach 1 Stunde wurde 1 ml Medium in die Vertiefung gegeben und das Medium 3 Stunden nach der Transfektion durch frisches Medium ersetzt. Am ersten Tag wurden die ESCs in eine 6-cm-Schale überführt und unter Verwendung von 250 µg/ml G418 selektiert. Am 9. Tag wurden ESC-Kolonien gepflückt und in Lysatpräparate für die PCR-Analyse und Zellkulturen zum erneuten Klonen und Vorbereiten gefrorener Zellbestände aufgeteilt. ESC-Lysate wurden durch Resuspendieren von ESC-Pellets in 20 µl Wasser und 10-minütiges Erhitzen auf 95 °C hergestellt, gefolgt von einem Proteinase-K-Verdau (400 µg/ml) bei 56 °C für 60 Minuten und einer Hitzeinaktivierung von Proteinase K bei 95 °C C für 10 Min. Für eine detaillierte Analyse der eingefügten Sequenz wurden einige ESC-Klone spärlich in Kulturschalen ausplattiert, um aus Einzelzellen stammende Kolonien zu erhalten. Nach dem Pflücken der Kolonien wurden die ESCs vermehrt und die genomische DNA mit der herkömmlichen Methode der Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt29.

Zielklone wurden durch PCR unter Verwendung von KOD FX-Polymerase (TOYOBO; KFX-101) mit den in der Ergänzungstabelle 1 gezeigten Primern gescreent. Für das erste Screening der Zielklone (Abb. 2B) wurde ESC-Lysat als Matrize verwendet. Für die Upstream- und Downstream-Rekombination (Primerpaare I und III in Abb. 2) waren die PCR-Bedingungen wie folgt: ein Zyklus bei 94 °C für 2 Minuten, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 10 Sekunden, Annealing bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 68 °C für 30 s, mit einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 68 °C für 1 Minute. Für die Amplifikation von Insertionssequenzen voller Länge (Primerpaar II in Abb. 2) wurden die Verlängerungszeit des PCR-Zyklus und die endgültige Verlängerungszeit nach dem PCR-Zyklus auf 3 Minuten festgelegt. Bei der Analyse erneut geklonter Zellen (Abb. 2C) wurde genomische DNA, die durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt wurde, als Matrize verwendet. Die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie für die Lysatanalyse, mit der Ausnahme, dass die Verlängerungszeit des PCR-Zyklus auf 8 Minuten und die letzte Verlängerungszeit nach dem PCR-Zyklus auf 5 Minuten eingestellt wurde, um den Nachweis langer Insertionssequenzen zu ermöglichen. Die PCR-Bedingungen für die heterozygote SNP-Analyse (Abb. 5B) und die Cre/loxP-Rekombination (Abb. 6B) waren die gleichen wie beim ersten PCR-Screening unter Verwendung von ESC-Lysat (Abb. 2B), mit Ausnahme der Verlängerungszeit der PCR Der Zyklus und der letzte Verlängerungsschritt wurden in der SNP-Analyse auf 4 Minuten bzw. 5 Minuten eingestellt.

PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen; 28704) gereinigt und mit dem Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific; 450245) in ein Plasmid kloniert. Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen; 27106) gereinigt, mit BsrGI verdaut und mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen; 28104) gereinigt. Die Long-Read-Sequenzierung wurde auf einem MinION-Sequenzer (Oxford Nanopore Technologies) unter Verwendung des 1D-Ligationssequenzierungskits (Oxford Nanopore Technologies; SQK-LSK109) und des nativen Barcoding-Kits (Oxford Nanopore Technologies; EXP-NBD103) durchgeführt. Rohsequenzlesevorgänge wurden mit Flye Version 2.616 zusammengestellt.

PCR-Produkte wurden entweder mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen; 28104) oder dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen; 28704) gereinigt und direkt mit dem BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific; 4337455) sequenziert. Die gesamte Sanger-Sequenzierung wurde an PCR-Produkten durchgeführt, nicht an der Plasmid-DNA mit dem eingefügten PCR-amplifizierten Fragment, um jegliche Verzerrung durch PCR-induzierte Mutationen zu vermeiden.

Die Long-Read-Sequenzierungsdaten sind im Sequencing Read Archive der DNA Data Bank of Japan (DDBJ) unter der Zugangsnummer DRA015430 verfügbar.

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Wir danken der NGS-Kerneinrichtung des Genome Information Research Center am Forschungsinstitut für mikrobielle Krankheiten der Universität Osaka für ihre Unterstützung bei der Nanoporensequenzierung und Datenanalyse. Wir danken Dr. Junji Takeda für die Bereitstellung von KY1.1-ESCs und Dr. Kosuke Yusa für das Plasmid pPGKneo-F2F. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (JP20H03174 für KH) unterstützt.

Abteilung für Physiologie II, Medizinische Universität Nara, Kashihara, Nara, 634-8521, Japan

Yuki Higashitani & Kyoji Horie

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KH hat die Studie konzipiert. YH und KH führten die Experimente durch. YH analysierte die Ergebnisse der Nanopore-Sequenzierung. YH und KH haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Kyoji Horie.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Higashitani, Y., Horie, K. Eine Long-Read-Sequenzanalyse der MMEJ-vermittelten CRISPR-Genombearbeitung deckt komplexe On-Target-Vektorinsertionen auf, die möglicherweise der standardmäßigen PCR-basierten Qualitätskontrolle entgehen. Sci Rep 13, 11652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38397-y

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Eingegangen: 19. April 2023

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38397-y

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