Die flüssige Tumormikroumgebung verstärkt den WNT-Signalweg der Peritonealmetastasierung von Magenkrebs

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11125 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Magenkrebs ist nach wie vor einer der häufigsten Tumoren weltweit und Peritonealmetastasen sind für etwa 60 % der Todesfälle bei Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs verantwortlich. Der zugrunde liegende Mechanismus der Peritonealmetastasierung ist jedoch kaum verstanden. Wir haben Organoide etabliert, die aus malignem Aszites (MA) von Magenkrebspatienten stammen, und haben festgestellt, dass MA-Überstand die Koloniebildung von Organoiden stark steigern kann. So erkannten wir, dass die Wechselwirkung zwischen exfoliierten Krebszellen (ECCs) und der Mikroumgebung des flüssigen Tumors zur Peritonealmetastasierung beiträgt. Darüber hinaus haben wir einen Kontrolltest mit mittleren Komponenten entwickelt, der bewies, dass von MA abgeleitete Exosomen das Wachstum von Organoiden nicht steigern konnten. Mithilfe von Immunfluoreszenz und konfokaler Bildgebung sowie einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay zeigten unsere Daten, dass der WNT-Signalweg durch hohe Konzentrationen an WNT-Liganden (wnt3a und wnt5a) hochreguliert wurde, was durch ELISA bestätigt wurde. Darüber hinaus verringerte die Unterdrückung des WNT-Signalwegs die wachstumsfördernde Funktion des MA-Überstands. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der WNT-Signalweg ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Peritonealmetastasierung von Magenkrebs ist.

Metastasierung ist die Haupttodesursache bei Krebspatienten. Insbesondere peritoneale Metastasen sind für etwa 60 % der Todesfälle bei Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs verantwortlich1. Maligner Aszites (MA) ist eines der häufigsten Symptome bei Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs und weist auf eine ungünstige Prognose hin.

Das Auftreten einer Implantationsmetastasierung beinhaltet die Verbreitung von ECCs und die Bildung prämetastatischer Nischen. Der mesothelial-mesenchymale Übergang (MMT) gilt als Schlüssel zu einer Reihe pathologischer Veränderungen2.

MA ist eine hypoxische, entzündliche und immunsuppressive Tumormikroumgebung, die aus komplexen Zytokin-Chemokinen, Wachstumsfaktoren, Exosomen und verschiedenen Suspensionszellen wie Tumormesothelzellen und Immunzellen besteht. Allerdings ist die Wechselwirkung zwischen ECCs und der Mikroumgebung des Tumors, beispielsweise die Vermeidung von Anoikis, noch wenig verstanden.

Bislang wurden Organoidlinien etabliert, die von verschiedenen Arten von Tumoren stammen und eine hohe Konsistenz in der biologischen Vererbung bewiesen3. Zu Beginn des Pilotprojekts wurden nacheinander zahlreiche Forschungsarbeiten durchgeführt, um die Machbarkeit des Einsatzes von Organoiden für das individualisierte Arzneimittelscreening zu überprüfen4,5,6. Die Bedeutung der Tumormikroumgebung für die Tumorentstehung und -progression wird mit fortschreitender Forschung zunehmend erkannt. Tumorstroma einschließlich Immunzellen wurde in das Organoid-Kultursystem eingebracht, um die Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen7,8.

Über Organoide, die normale Mageneinheiten und Magenkrebs modellieren, wurde bereits berichtet9. Unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls haben wir Organoide aus MA von Magenkrebspatienten etabliert und festgestellt, dass der MA-Überstand die Koloniebildung von aus malignem Aszites stammenden Organoiden (MADO) stark steigern kann10. Wir haben die Heterogenität sowohl zwischen primärem Magenkrebs und ECCs als auch deren unterschiedlichen Mikroumgebungen berücksichtigt, die zu diesem Phänomen führen. Tatsächlich wurde bereits über die Vielfalt des Mutationsspektrums zwischen Primärtumoren und ECCs bei MA berichtet11.

Daher wollten wir herausfinden, wie die MA-Mikroumgebung das bösartige biologische Verhalten von ECCs verstärkt. Hier zeigen wir, dass im Aszitesüberstand hohe Mengen an WNT-Liganden (wnt3a und wnt5a) vorhanden sind, die den WNT-Signalweg hochregulieren.

MA wurde von Magenkrebspatienten gesammelt, die sich einer palliativen Parazentese unterzogen. Alle diese Fälle wurden durch eine Operation oder endoskopische Biopsie pathologisch als Adenokarzinom des Magens bestätigt, und durch flüssigkeitsbasierte Dünnschichtzytologie wurde bestätigt, dass ihr Aszites Tumorzellen enthielt. Alle beteiligten Patienten unterzeichneten eine Einverständniserklärung. Alle Gewebesammlungen und Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der Deklaration von Helsinki (2013) durchgeführt und von der örtlichen Ethikkommission (Committee on Ethics of Medicine, Navy Medical University, PLA) genehmigt. Die spezifischen Ethikdokumente finden Sie elektronisch im Abschnitt „Zugehörige Dateien“ dieses Artikels.

Die Drainage einer Bauchpunktion wurde klinisch durchgeführt und der Aszites im Drainagebeutel wurde in einer trockenen, sterilen Flasche von etwa 200 ml gesammelt. Alle diese Proben wurden bei einer Temperatur von 4 °C ins Labor transportiert, während die experimentelle Behandlung innerhalb von 6 Stunden durchgeführt wurde.

Bei der Ankunft wurde MA mit einer 70-μm-Membran filtriert, um Feststoffsuspensionen zu entfernen. Anschließend wurde MA 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert, um die EECs anzureichern. Der Überstand wurde 30 Minuten bei 56 °C inkubiert und nach 10-minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min mit einer 0,22-μm-Membran filtriert. In der Zwischenzeit wurden angereicherte EECs gesammelt und in wachstumsfaktorreduziertem Matrigel (Corning 356,231) in einer vorgewärmten Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen (Costar, 3524) mit 400 Zellclustern oder 1000–2000 Einzelzellen in einer Vertiefung ausgesät. 500 μl MADO-Kulturmedium (Ergänzungstabelle 1) oder die Mischung aus obigem Überstand und MADO-Kulturmedium wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platten in Inkubatoren mit 37 °C/5 % CO2 überführt.

Das Medium wurde alle drei Tage erneuert. Wir beobachten kontinuierlich MADOs und machen bei Bedarf Fotos. Die Passage von MADOs erfolgte im Wesentlichen wie von Jie Li et al.10 beschrieben. Insbesondere wurden MADOs aus dem Matrigel entfernt, mechanisch in kleine Fragmente dissoziiert und wie oben beschrieben mit frischem Kulturmedium auf frisches Matrigel übertragen.

Die Zellproliferation/das Zellwachstum wurde durch CCK8-Assays (HY-K0301, MCE) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, die Zellen wurden wie oben beschrieben dreifach in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 100 Zellclustern/10 μl Matrigel ausgesät. Zu den angegebenen Zeitpunkten (Tag 1, Tag 3, Tag 6 und Tag 9) wurde Farbstofflösung (DMEM/F12: CCK-8-Kit = 10:1) zugegeben und die Platten 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert bevor die Absorption bei 450 nm nachgewiesen wurde. Jeder Test wurde dreifach durchgeführt. Anschließend wurden die Kulturmedien aufgefrischt.

Für WB wurden Zellen gesammelt und in RIPA-Puffer (Cell Signaling) mit einem vollständigen Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche), Phosphataseinhibitoren (Roche) und PMSF (Sigma) lysiert und dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 g zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Protein-Assay-Kit von Bio-Rad (Hercules, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Western-Blot-Assays wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt12. Die primären Antikörper wurden wie folgt erhalten: Anti-Caspase-3, Anti-PCNA, Anti-β-Catenin, Anti-Non-Phospho (aktives) β-Catenin und Exosomal Marker Antibody Sampler Kit-Antikörper (Flotillin-1 und EpCAM). von Cell Signaling Technology, Anti-β-Aktin-Antikörper von Abmart.

Der oben gesammelte Überstand wurde 30 Minuten lang bei 4 °C und 20.000 × g zentrifugiert, um abgelöste Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde dann 2 Stunden lang bei 4 °C und 150.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der transparente gelatineartige Niederschlag wurde in kaltem PBS resuspendiert und dann wurde der letzte Schritt oben zur weiteren Verfeinerung wiederholt. Für den Proteintest wurde der Exosomenfraktion 10 × RIPA-Puffer mit 10 % PMSF und Phosphataseinhibitoren zugesetzt, 15 Minuten auf Eis inkubiert und auf das Mikro-BCA-Proteintestsystem (ThermoFisher Scientific) angewendet.

Die Exosomenproben wurden wie zuvor beschrieben negativ gefärbt13. Ein mit Formvar/Kohlenstofffilmen beschichtetes 400-Mesh-Kupfergitter wurde hydrophil behandelt. Die Exosomensuspension (5 bis 10 μl) wurde auf Parafilm gegeben und das Gitter auf der Exosomenflüssigkeit geschwommen und 15 Minuten stehen gelassen. Die Probe wurde 2 Minuten lang mit 2 %iger Uranylacetatlösung negativ gefärbt. Exosomen auf dem Gitter wurden mit 40.000-facher Vergrößerung mit einem H-7650-Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi, Tokio, Japan) am Central Research Laboratory der Second Military Medical University sichtbar gemacht.

MADOs wurden auf konfokalen 35-mm-Petrischalen mit Deckglasboden (BIO-IMAG) kultiviert. Immunfluoreszenz und konfokale Bildgebung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt14. Nach dem Wachstum auf eine geeignete Dichte wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert, mit PBS, das 10 % Ziegenserum enthielt, blockiert und über Nacht mit Antikörpern bei 4 °C inkubiert. Fixierte und gefärbte Schalen wurden dreimal mit PBS gewaschen und primäre Antikörper wurden durch Inkubation mit Alexa Fluor-konjugierten sekundären Antikörpern (Invitrogen) markiert. Die Schalen wurden dann mit einem Eindeckmedium, das DAPI (Prolong Gold Antifade Reagent, Life Technologies) enthielt, montiert und die Zellen wurden mit konfokaler Lasermikroskopie (Carl Zeiss) sichtbar gemacht.

Der Dual-Luciferase-Reporter-Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt15. Insbesondere wurden MGC-803-Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert, die PDO-Medien und MA-Medien enthielten. Anschließend wurden die Zellen nach dreitägiger Kultivierung mit TOP-Plasmiden cotransfiziert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion gesammelt und die Luciferase-Aktivitäten wurden mit dem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit (Beyotime, RG027) analysiert. Die Reporteraktivität wurde auf die Kontroll-Renilla normalisiert.

Nachdem die MADOs subkultiviert und die Tumorzellen auf eine ausreichende Anzahl vermehrt worden waren, wurden die mechanisch getrennten MADOs-Fragmente gleichmäßig mit Matrigel (Corning 356231) gemischt und in eine Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen (Costar, 3516) mit 100 Zellclustern oder 250–500 ausgesät einzelne Zellen pro Vertiefung. Der Arzneimittelsensitivitätstest wurde durchgeführt, als jede Vertiefung etwa 200 ± 50 MADOs in 15 ml Matrigel mit 300 ml Kulturmedium enthielt. Salinomycin (MCE, HY-15579) und Stachelschweininhibitor (Porcn-IN-1, MCE, HY-111472) wurden in MADOs-Medium entsprechend den unterschiedlichen Konzentrationen (zehnfache Verdünnung) hergestellt. Nachdem die MADOs unter geeigneten Bedingungen gezüchtet worden waren, wurde das vorbereitete Medium mit Wirkstoffkonzentrationsgradienten hinzugefügt. Nach 3 Tagen medikamentöser Behandlung wurde das wirkstoffhaltige Medium aufgefrischt und weitere 3 Tage medikamentöser Behandlung wiederholt. Anschließend wurde die Zelllebensfähigkeit von MADOs in jeder Vertiefung ermittelt. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden MADOs mit dem Cell Counting Kit-8 (MCE, HY-K0301) behandelt und der OD-Wert jeder Vertiefung wurde durch Cytation5 (BioTek) ermittelt. Die OD-Werte (optische Dichte) der Dosierungsgruppe und der Kontrollgruppe wurden in die Überlebensrate der MADOs in jeder Vertiefung umgerechnet und dann wurde Graphpad Prism8 verwendet, um eine passende Kurve zwischen verschiedenen Salinomycin-Konzentrationen (lg) und der Überlebensrate von zu erstellen MADOs. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) von Salinomycin in MADOs wurde berechnet und eine geeignete Arzneimittelkonzentration für das Experiment zur Hemmung des WNT-Signalwegs ausgewählt. Jeder Test wurde dreifach durchgeführt. Die Konzentration von Porcn-IN-1 entspricht den MCE-Richtlinien (https://www.medchemexpress.cn/Porcupine-IN-1.html), 0,5 ± 0,2 nM, und wir wählen schließlich die geeignete Arzneimittelkonzentration entsprechend aus die aktuelle Situation.

Während der oben genannten MADOs-Kultur wurde der Mediumüberstand alle 3 Tage gesammelt. Die Proben wurden 3 Minuten lang bei 4 °C mit 1000 U/min zentrifugiert, um mögliche Zellbestandteile zu entfernen, und das Medium wurde abgetrennt und zur weiteren Analyse innerhalb von 2 Stunden bei –80 °C gelagert. Die Wnt-3a/Wnt-5a-Spiegel in Mediumproben wurden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) gemäß den Empfehlungen des Herstellers (CUSABIO, CSB-EL026136HU/CSB-EL026138HU, Houston, USA) gemessen. Alle Messungen wurden für jede Probe doppelt durchgeführt und der Mittelwert berechnet.

Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von MADOs wurde mit ImageJ wie zuvor beschrieben gemessen16. Statistische Analysen wurden mit Prism GraphPad durchgeführt. Für Mehrgruppenvergleiche wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. Alle Werte werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (Sem) angezeigt. P ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Changhai-Krankenhauses der Zweiten Militärmedizinischen Universität (CHEC2016-157) genehmigt und von allen Patienten oder ihren Erziehungsberechtigten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Mithilfe der Zeitrafferfotografie konnten wir Veränderungen im einzelnen Organoid beschreiben. Der MA-Überstand steigerte die Bildungseffizienz und Größe von Organoiden deutlich, indem er die Zellteilung förderte. Um auszuschließen, ob der individuelle Unterschied auf Tumorzellen oder die Tumormikroumgebung zurückzuführen ist, haben wir einen Kreuzvergleichstest entwickelt, bei dem MADO-Linien mit elterlichem bzw. nicht elterlichem Aszitesüberstand inkubiert wurden (Abb. 1A, B, ergänzende Abb. 1). Wie erwartet steigerten sowohl der parentale als auch der nicht-elterliche Aszitesüberstand die Koloniebildung von MADOs. Wir fragen uns, ob der MA-Überstand den gleichen Effekt auf subkultivierte MADOs hat. Es überrascht nicht, dass wir durch CCK8-Assays zur Koloniezahlzählung eine erhöhte Zellproliferation und Koloniebildung sowohl bei primären MADOs (P0) als auch bei subkultivierten MADOs (P1) beobachteten (Abb. 1C – F). Außerdem bilden primäre Tumorzellen ohne MA-Überstand kaum Organoide, während MA-Überstand nur die Wachstumsrate von P1-MADOs zu beeinflussen scheint. Interessanterweise stellten wir fest, dass sowohl die Proliferation als auch die Apoptose von MADOs zunahmen, wenn sie durch MA-Überstand stimuliert wurden (Abb. 1G). Wir haben daher die Hypothese aufgestellt, dass es eine gemeinsame Substanz gibt, die zu den wachstumsfördernden Wirkungen auf MADOs bei Aszites beiträgt.

Sowohl der parentale als auch der nicht-elterliche Aszitesüberstand fördern das Wachstum von MADOs. (A) Repräsentative Hellfeldbilder einer Organoidlinie, die von einem Patienten (P1) mit Magenkarzinom stammte, was darauf hindeutet, dass das Wachstum von MADOs durch Zugabe des angegebenen Anteils an Überstand, der aus elterlichem Aszites stammte, erhöht wurde (A1:25 %, 50). %) oder das Gegenstück eines anderen Patienten (P2) (A2:25 %, 50 %). Maßstabsbalken, 100 μm. (B) Histogramm, das den Wachstumsbereich der oben behandelten MADOs darstellt (Tag 9). Die Daten geben den Mittelwert ± SD an und wurden mit dem Student-t-Test analysiert (**p < 0,01; ***p < 0,001). (C) Repräsentative Bilder der Primärkultur (P0) und Subkultur (P1) von MADOs, aufgenommen unter Agilent BioTek Cytation, behandelt mit PDO-Medium oder Medien mit 25 % Aszitesüberstand. Maßstabsbalken, 2000 μm. (D,E) Proliferation von P0- und P1-MADOs, bestimmt durch CCK8-Assays. (F) Koloniezahlzählung der P0- und P1-MADOs oben. (G) Western-Blot-Analyse von Caspase-3 und PCNA in MADOs oben (Tag 9).

Neben verschiedenen suspendierten Zellen wie Mesothelzellen und Immunzellen bilden komplexe Zytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren und Exosomen die extrazelluläre Umgebung von EECs. Um festzustellen, ob Exosomen das Wachstum von MADOs direkt fördern, haben wir Exosomen aus MA mithilfe der Ultrazentrifugationsmethode gereinigt und dabei auf die von Yanting Hu13 beschriebene Methode zurückgegriffen und diese verbessert. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass die Größenverteilung der gereinigten Exosomen zwischen 40 und 100 nm mit klassischer Scheibenmorphologie lag (ergänzende Abbildung 2). Darüber hinaus ergab die Western-Blot-Analyse von aus Exosomen extrahiertem Protein das Vorhandensein spezifischer Exosomenmarker (Flotillin-1 und EpCAM). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Hauptinhalt der gereinigten Mikrovesikel Exosomen waren.

Um die Abweichung auszuschließen, die wahrscheinlich durch die biologische Dysfunktion der Exosomen während des Extraktionsprozesses verursacht wird, führten wir einen Medienkomponenten-Kontrolltest durch, bei dem MADOs durch Exosomen, den MA-Überstand der Eltern (hier 25 %) und den verbleibenden Teil des MA-Überstands stimuliert wurden. Wir beobachteten, dass Exosomen keinen signifikanten Einfluss auf das Wachstum von MADOs hatten. Umgekehrt förderte die verbleibende Teilgruppe das Wachstum der MADOs stark, was der MA-Gruppe sehr nahe kam (Abb. 2). Dieser Test zeigte, dass Exosomen das Wachstum von MADOs nicht direkt fördern können, das heißt, dass die Substanzen, die zu den wachstumsfördernden Wirkungen auf MADOs bei Aszites beitragen, tatsächlich im Überstand von MA statt in Exosomen vorhanden sind.

Aus Aszites gewonnene Exosome können das Wachstum von MADOs nicht fördern. (A) Repräsentative Hellfeldbilder eines MADOs, das mit dem Überstand des Aszites (A), dem aus demselben und dem doppelten Volumen des Aszites isolierten Exosom (1xE, 2xE) und dem verbleibenden Teil des Aszites (R) behandelt wurde. Maßstabsbalken, 210 μm. (B) Histogramm, das den Wachstumsbereich der oben behandelten MADOs darstellt. (C) Histogramm, das die Durchmesser der einzelnen oben behandelten MADO darstellt. Die Daten geben den Mittelwert ± SD an und wurden mit dem Student-t-Test analysiert (*p < 0,05; **p < 0,01; NS p > 0,05).

Um herauszufinden, welche wachstumsfördernde Wirkung über welchen Signalweg erzeugt wird, verwendeten wir Western-Blot-Assays, um die wichtigsten Proteinexpressionsniveaus mehrerer Magenkrebs-Zelllinien zu testen (ergänzende Abbildung 4). Nach Stimulation durch MA-Überstand stellten wir erhöhte Spiegel an Nicht-Phospho-β-Catenin fest, das auch als aktives β-Catenin im WNT-Signalweg bekannt ist (ergänzende Abbildung 3). Unterdessen blieb das Ausmaß der gesamten β-Catenin-Expression nach der Behandlung gleich. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die kanonische WNT-Signalübertragung von Magenkrebszelllinien hochreguliert wird, wenn sie durch MA-Überstand stimuliert werden.

Um den gleichen Effekt auf MADOs weiter zu untersuchen, haben wir das Expressionsniveau von Nicht-Phospho-β-Catenin vor und nach der Behandlung ermittelt. Wir verwendeten eine semiquantitative Methode, um die Intensität des Fluoreszenzsignals zu analysieren (Abb. 3). Wie erwartet zeigten sowohl die MA-Gruppe (M) als auch die verbleibende Teilgruppe (R) nach der Behandlung ein höheres Fluoreszenzsignal, mit Ausnahme der Exosomengruppe (E).

Der Aszitesüberstand regulierte die Signalübertragung von aktivem β-Catenin hoch. (A) Immunfluoreszenz zur Lokalisierung von aktivem β-Catenin in MADOs, die mit Aszitesüberstand (A), Exosom, das aus dem gleichen Volumen des Aszites (E) und dem verbleibenden Teil des Aszites (R) isoliert wurde, behandelt wurden. Maßstabsbalken, 100 μm. (B) Statistische Streudiagramme, die die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der oben behandelten MADOs darstellen. Die Daten geben den Mittelwert ± SD an und wurden mit dem Student-t-Test analysiert (**p < 0,01; NS p > 0,05). (C) Histogramm, das die relative Luciferase-Aktivität des Topflash-Reporters in AGS-803-Zellen darstellt. Die Daten geben den Mittelwert ± SD an und wurden mit dem Student-t-Test analysiert (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; NS p > 0,05).

Nach der Stimulierung durch MA wurde die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signals in MGC-803 durch die hohe Luciferase-Aktivität des Toplash-Reporters weiter belegt (Abb. 3C). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse darauf hindeuten, dass der WNT-Signalweg in MADOs aktiviert wird, nachdem er durch MA-Überstand stimuliert wurde.

Wir haben die Konzentration von wnt3a und wnt5a sowohl in PDO-Medien als auch in Medien mit 25 % MA-Überstand zu den angegebenen Zeitpunkten nachgewiesen (Abb. 1C, 4A, B, Tabelle S2). Wir fanden heraus, dass der Gehalt an Wnt3a und Wnt5a im MA-Überstand etwa 13- bzw. 15,8-mal höher war als im PDO-Medium. Interessanterweise nahm Wnt3a/Wnt5a in den Kulturmedien zunächst ab und stieg dann während der Kultivierung von MADOs an, was auf ein dynamisches Niveau von Wnt3a/Wnt5a während der Kultivierung von MADOs hinwies.

Eine hohe Konzentration an WNTs im Aszites fördert das Wachstum von MADOs, das durch Blockierung der WNT-Signalübertragung unterdrückt werden könnte. (A,B) Liniendiagramme zeigen die Konzentration von Wnts in Kulturmedien während der P0- und P1-MADO-Kultur zu angegebenen Zeitpunkten (Tag 0, Tag 3, Tag 6 und Tag 9), gemessen mit ELISA. Die statistische Analyse belegt an jedem Testpunkt signifikante Unterschiede zwischen der PDO-Mediengruppe und der 25 %-Aszites-Gruppe. (C) Repräsentative Hellfeldbilder eines mit Salinomycin behandelten MADOs (S), Aszitesüberstand (A), der Wnt 3a/R-Spondin 1 (− W/R) entfernt. (D) Histogramm, das den Wachstumsbereich der oben behandelten MADOs darstellt. Die Daten geben den Mittelwert ± SD an und wurden mit dem Student-t-Test analysiert (*p < 0,05; **p < 0,01).

Wenn MADOs 12 Tage lang kultiviert wurden, übertraf die Konzentration von Wnt3a und Wnt5a in den Kulturmedien sogar das ursprüngliche Gegenstück (ergänzende Abbildung 5A). Dies ist ein überzeugender Beweis dafür, dass es während der MADO-Kultur autokrine Prozesse gibt. Dann verwendeten wir Porcupine-Inhibitor (Porcn-IN-1), um die Sekretion von Wnts am Tag 9 zu hemmen, als der Wendepunkt der Konzentrationsänderungen lag. Trotz fehlender statistischer Signifikanz gab es einen Abwärtstrend bei Wnt3a und Wnt5a, als Porcn-IN-1 eine Konzentration von 5 nM aufwies (ergänzende Abbildung 5C, D). Wir stellten jedoch fest, dass die Proliferation deutlich zurückging (ergänzende Abbildung 5B).

Um zu bestätigen, ob die Aktivierung des WNT-Signals zu einem beschleunigten Wachstum von MADOs führt, führten wir einen WNT-Signalhemmtest durch, um das Wachstum von MADOs zu beobachten. Hier verwendeten wir Salinomycin, das die Wnt-induzierte LRP6-Phosphorylierung blockiert, um die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung zu hemmen. Zunächst führten wir einen Arzneimittelsensitivitätstest durch, um die geeignete Arzneimittelkonzentration gegenüber MADOs zu bestätigen. Unter Bezugnahme auf den vorherigen Bericht haben wir sechs Gradientenkonzentrationen (100 µM, 10 µM, 1 µM, 0,1 µM und 0,01 µM) eingerichtet, um die Reaktion von vier MADO-Kandidaten zu testen17. Anschließend wurden die reproduzierbaren Dosis-Wirkungs-Kurven und die halbmaximalen Hemmkonzentrationen (IC50) erstellt und identifiziert (ergänzende Abbildung 6). Die IC50-Werte liegen zwischen 0,024 und 0,1971 µM und der Maximalwert (hier 0,2 µM) wurde ausgewählt, um die Reaktion von MADOs zu testen.

Wie erwartet wurde das Wachstum von MADOs gehemmt, unabhängig davon, ob sie mit dem WNT-Inhibitor Salinomycin behandelt oder unter Wnt-Entzug kultiviert wurden. Wir stellten fest, dass der beschleunigende Effekt des MA-Überstands eliminiert wurde, wenn das WNT-Signal blockiert wurde. Die durch die Wnt-Deletion verursachte Wachstumshemmung wurde jedoch durch den MA-Überstand rückgängig gemacht (Abb. 4C, D). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass der MA-Überstand das Wachstum von MADOs durch die Aktivierung des WNT-Signalwegs stark fördert.

Das Phänomen, das wir bei der Optimierung der MADO-Kulturbedingungen festgestellt haben, legt nahe, dass die derzeitige künstliche Nische nicht ausreicht, um die Mikroumgebung von EECs zu simulieren. Das erste, was wir herausfinden müssen, ist, ob die wachstumsfördernde Wirkung spezifisch ist oder nicht, ob die Wirkung nur zwischen EECs und dem Aszitesüberstand der Eltern besteht. Durch den Kreuzvergleichstest stellten wir fest, dass sowohl der Aszitesüberstand der Eltern als auch der Nicht-Eltern das Wachstum von MADOs förderte. Darüber hinaus könnte der MA-Überstand das Wachstum subkultivierter MADOs stark fördern. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Wachstumsförderung des MA-Überstands auf MADOs universell ist. Wir stellten fest, dass primäre Tumorzellen stärker vom MA-Überstand abhängig waren als subkultivierte MADOs. Dies kann mit Unterschieden zwischen primären Tumorzellen und organoiden Strukturen zusammenhängen.

Neben einem komplexen Zytokincocktail schweben reichlich Exosomen im Aszites. Angesichts der ausgereiften Technologie zur Extraktion von Exosomen haben wir zunächst das Exosom getestet, um zu überprüfen, ob es der auslösende Wirkstoff ist. Das Ergebnis zeigte, dass Exosomen das Wachstum von MADOs nicht direkt steigern können. Interessanterweise stellten wir fest, dass Exosomen zu einer morphologischen Veränderung der MADOs führen, die von einer kugelförmigen zu einer lockeren Morphologie führt. Yanting Hu et al. zeigten, dass aus bösartigem Aszites stammende Exosomen von GC-Patienten die Verbreitung peritonealer Tumorzellen über die Förderung der EMT-Signalisierung fördern13. Diese Daten deuten darauf hin, dass Exosomen im Aszites hauptsächlich die Verbreitung von Peritonealtumorzellen und nicht die Proliferation fördern.

Anders als bei normalem Parakarzinomgewebe und Tumorgewebe fehlt bei MA der entsprechende Kontrast. Frühere Studien versuchten, Proteinmarker zu finden, indem sie MA mit anderen Arten von Aszites, wie z. B. Zirrhose-Aszites, verglichen18. Aufgrund des großen Fehlers, der durch individuelle Unterschiede verursacht wird, ist diese Methode für die Differenzselektion ungeeignet.

Daher haben wir uns daran gemacht, den zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Angesichts des langen Zeitraums und der hohen Kosten für die Durchführung von Western-Blot-Analysen an Organoiden verwendeten wir mehrere Zelllinien (SNU5, SNU16, AGS, MKN28 und MGC803), um eine Reihe von Schlüsselproteinen mehrerer klassischer Signalwege im Zusammenhang mit der Proliferation wie β zu testen -Catenin, mTor, p-Stat3, p-ERK. Die Ergebnisse zeigten, dass die kanonische Wnt/β-Catenin-Signalübertragung nach Stimulation durch Aszitesüberstand aktiviert wurde. Wir haben außerdem gezeigt, dass der MA-Überstand den WNT-Signalweg von MADOs hochreguliert. ELISA validierte höhere Konzentrationen an WNT-Liganden (wnt3a und wnt5a) im MA-Überstand als in PDO-Medien.

In letzter Zeit wurde vielfach diskutiert, dass Wnts den WNT-Signalweg durch Autokrine aktivieren19,20. Hier haben wir gezeigt, dass während der Kultivierung von MADOs autokrine WNT-Liganden existieren. Dies könnte zumindest teilweise zur hohen Konzentration an WNT-Liganden in MA beitragen. Wir bemerkten auch den Abwärtstrend der Wnts-Konzentrationen und die wachstumshemmende Wirkung, wenn der Porcupine-Inhibitor verwendet wurde. Dies verdeutlichte die wichtige Rolle von Wnt-Liganden bei MA aus der Perspektive des Zellwachstumsstatus. Es ist auch erwähnenswert, dass die Wirkung der Porcupine-Blockierung in vitro möglicherweise unterschätzt wird, da der bereitgestellte MA-Überstand fixiert war.

Unter Berücksichtigung sowohl der Wachstumssituation als auch der Änderungen in der WNT-Ligandenkonzentration gehen wir von zwei unterschiedlichen Stadien während der MADO-Kultivierung aus. Im Frühstadium sind Tumorzellen auf hohe Konzentrationen an WNT-Liganden angewiesen, um zu „starten“, und WNT-Liganden werden in diesem Zeitraum stark verbraucht. Im Spätstadium nutzen autokrine WNT-Liganden ihre Vorteile, da sich kugelbildende Zellen und Tumorzellen vermehren, während hohe Mengen an WNT-Liganden eine positive Rückkopplung auslösen, um das Wachstum von MADOs zu fördern. Interessanterweise scheinen primäre Tumorzellen auf höhere Mengen an WNTs angewiesen zu sein als Organoide. Dies könnte mit einer verbesserten Resistenz von MADOs gegenüber einer Umgebung mit niedrigen WNT-Liganden durch Kugelbildung und Evolution zusammenhängen.

Die WNT-Signaltransduktionskaskade ist in der Evolution konserviert und mit unzähligen biologischen Phänomenen verbunden. Wie es Stammzellen kontrolliert und zu Krankheiten beiträgt, wurde von Roel Nusse et al.21 beschrieben. Der Wnt-Signalweg-Agonist R-Spondin, der epidermale Wachstumsfaktor EGF und der BMP-Inhibitor Noggin bilden eine künstliche Nische für die Selbsterneuerung von Organoiden in vitro. Seidlitz T, et al. beobachteten, dass der Abhängigkeitsgrad des Wnt-Signals in GC-Organoiden, die von verschiedenen Patienten stammen, stark variiert22. Nanki et al. Aufgedeckte Mechanismen, durch die GC-Organoide einen Wnt-unabhängigen Phänotyp erwerben, nämlich die Selbstsekretion von Wnt, APC-Mutationen und die epigenetische WRi-Regulation23. Hier ergänzte unsere Studie die wichtige Rolle der WNT-Signalübertragung bei der Magen-Peritonealmetastasierung.

Hier fehlt in unserer Studie der Nachweis einer APC-Mutation, die zur Selbstaktivierung des WNT-Signalwegs führen kann, was die unterschiedlichen Reaktionen von MADOs auf MA-Überstand zu erklären scheint.

In dieser Studie haben wir eine vorläufige Untersuchung des Mechanismus durchgeführt, der dazu führt, dass Aszitesüberstand die Koloniebildung von MADOs steigert. Wir fanden heraus, dass Exosomen das Wachstum von MADOs nicht direkt fördern können. Hiermit haben wir gezeigt, dass hohe Konzentrationen von WNT-Liganden in malignem Aszites die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs hochregulieren, und wir haben außerdem gezeigt, dass es möglich ist, auf den WNT-Signalweg abzuzielen.

Die in der Studie vorgestellten Originalbeiträge sind im Artikel/Ergänzungsmaterial enthalten. Weitere Anfragen können an die entsprechenden Autoren gerichtet werden.

Montori, G. & Coccolini, F. Die Behandlung von Peritonealkarzinomatose bei fortgeschrittenem Magenkrebs: Stand der Technik. Int. J. Surg. Onkol. 2014, 912418. https://doi.org/10.1155/2014/912418 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rynne-Vidal, A., Jimenez-Heffernan, JA, Fernandez-Chacon, C., Lopez-Cabrera, M. & Sandoval, P. Der mesotheliale Ursprung von Karzinom-assoziierten Fibroblasten bei Peritonealmetastasen. Krebserkrankungen 7, 1994–2011. https://doi.org/10.3390/cancers7040872 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drost, J. & Clevers, H. Organoide in der Krebsforschung. Nat. Rev. Cancer 18, 407–418. https://doi.org/10.1038/s41568-018-0007-6 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vlachogiannis, G. et al. Von Patienten gewonnene Organoide modellieren das Ansprechen auf die Behandlung von metastasiertem Magen-Darm-Krebs. Wissenschaft 359, 920–926. https://doi.org/10.1126/science.aao2774 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Yao, Y. et al. Von Patienten gewonnene Organoide sagen Radiochemoreaktionen bei lokal fortgeschrittenem Rektumkarzinom voraus. Zellstammzelle 26, 17-26.e16. https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.10.010 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ooft, SN et al. Von Patienten gewonnene Organoide können das Ansprechen auf eine Chemotherapie bei Patienten mit metastasiertem Darmkrebs vorhersagen. Wissenschaft. Übers. Med. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aay2574 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Dijkstra, KK et al. Erzeugung tumorreaktiver T-Zellen durch Co-Kultur von peripheren Blutlymphozyten und Tumororganoiden. Zelle 174, 1586. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.009 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neal, JT et al. Organoidmodellierung der Tumor-Immunmikroumgebung. Zelle 175, 1972-1988.e1916. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.11.021 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartfeld, S. et al. In-vitro-Expansion menschlicher Magenepithelstammzellen und ihre Reaktionen auf bakterielle Infektionen. Gastroenterologie 148, 126-136e126. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.09.042 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Li, J. et al. Von malignem Aszites abgeleitete Organoidkulturen (MADO) für die In-vitro-Modellierung und das Arzneimittelscreening von Magenkrebs. J. Cancer Res. Klin. Onkol. https://doi.org/10.1007/s00432-019-03004-z (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lim, B. et al. Genetische Veränderungen und ihre klinischen Auswirkungen bei Magenkrebs-Peritonealkarzinomatose, aufgedeckt durch Sequenzierung des gesamten Exoms von malignem Aszites. Oncotarget 7, 8055–8066 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang, RX et al. Der Verlust von Wwox treibt die Metastasierung bei dreifach negativem Brustkrebs durch die JAK2/STAT3-Achse voran. Nat. Komm. 9, 12. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05852-8 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Hu, YT et al. Von bösartigem Aszites abgeleitete Exosomen fördern die Verbreitung von Peritonealtumorzellen und zeigen eine deutliche miRNA-Signatur bei fortgeschrittenem Magenkrebs. Krebs Lett. 457, 142–150. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.04.034 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Song, L. et al. SORBS1 unterdrückt die Tumormetastasierung und verbessert die Empfindlichkeit von Krebs gegenüber Chemotherapeutika. Oncotarget 8, 9108–9122. https://doi.org/10.18632/oncotarget.12851 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Yang, S. et al. FOXP3 fördert das Tumorwachstum und die Metastasierung durch Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs und der EMT bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs. Mol. Krebs 16, 124. https://doi.org/10.1186/s12943-017-0700-1 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jensen, EC Quantitative Analyse histologischer Färbung und Fluoreszenz mit ImageJ. Anat. Empf. 296, 378–381. https://doi.org/10.1002/ar.22641 (2013).

Artikel Google Scholar

Lu, D. et al. Salinomycin hemmt die Wnt-Signalübertragung und induziert selektiv Apoptose in chronisch lymphatischen Leukämiezellen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 108, 13253–13257. https://doi.org/10.1073/pnas.1110431108 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Jin, J. et al. Vergleichende proteomische Analyse menschlicher bösartiger Aszitesflüssigkeiten zur Entwicklung von Magenkrebs-Biomarkern. Klin. Biochem. 56, 55–61. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2018.04.003 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Habara, O., Logan, CY, Kanai-Azuma, M., Nusse, R. & Takase, HM Die WNT-Signalübertragung in Prägranulosazellen ist für die Follikulogenese der Eierstöcke und die weibliche Fruchtbarkeit erforderlich. Entwicklung https://doi.org/10.1242/dev.198846 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Aguilera, KY et al. Die Stachelschweinhemmung stört die Mitochondrienfunktion und Homöostase bei WNT-Liganden-abhängigem Bauchspeicheldrüsenkrebs. Mol. Krebs Ther. 21, 936–947. https://doi.org/10.1158/1535-7163.Mct-21-0623 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nusse, R. & Clevers, H. Wnt/β-Catenin-Signalisierung, Krankheit und neue Therapiemodalitäten. Zelle 169, 985–999. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.016 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seidlitz, T. et al. Modellierung von menschlichem Magenkrebs mithilfe von Organoiden. Gut 68, 207–217. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2017-314549 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nanki, K. et al. Divergente Wege zur Nischenunabhängigkeit von Wnt und R-Spondin während der Magenkarzinogenese beim Menschen. Zelle 174, 856-869e817. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.027 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Wir danken Professor Lixing Zhan für seine Hilfe bei biologischen Experimenten.

Die vorliegende Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82072707), des Wissenschaftlichen Forschungsprogramms der Shanghai Municipal Commission of Science and Technology (19411970700 und 20Y11909400), des Changhai Hospital 234 Project (2019YXK019 und 2020YXK029) und des Wissenschaftlichen Forschungsprogramms unterstützt der Nantong Municipal Commission of Health and Care (QB2021051).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Huawei Xu, Zhibin Hao und Yujie Wang.

Abteilung für Onkologie, Changhai-Krankenhaus, Naval Military Medical University, Shanghai, 200433, China

Huawei Xu, Zhibin Hao, Yujie Wang, Jie Li, Ling Chen, Xiaobo Peng und Xianbao Zhan

Abteilung für Onkologie, Tongzhou People's Hospital, Nantong, 226300, China

Huawei Xu & Binbin Qian

Forschung und frühe Entwicklung, Haobai Biotechnology Inc, Shanghai, 200235, China

Deng Zhang

Abteilung für Onkologie, angegliedertes Krankenhaus der Universität Nantong, Nantong, 226000, China

Ninghua Yao

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HX: Design, Datenanalyse und -interpretation, Verfassen von Manuskripten. ZH und YW: Datenerhebung und -analyse. DZ: Drogensensitivitätstest. JL, LC, NY und BQ: Überarbeitung des Manuskripts. XZ und XP: Konzeption und Design, Studienbetreuung, Datenanalyse und Überarbeitung des Manuskripts. Alle Autoren haben zum Artikel beigetragen und die eingereichte Version genehmigt.

Korrespondenz mit Xiaobo Peng oder Xianbao Zhan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xu, H., Hao, Z., Wang, Y. et al. Die flüssige Tumormikroumgebung verstärkt den WNT-Signalweg der Peritonealmetastasierung von Magenkrebs. Sci Rep 13, 11125 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38373-6

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Eingegangen: 19. Dezember 2022

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 10. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38373-6

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Die flüssige Tumormikroumgebung verstärkt den WNT-Signalweg der Peritonealmetastasierung von Magenkrebs