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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12554 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Metaboliten des Tryptophan-Abbaus, die entlang des Kynurenin-Wegs gebildet werden, spielen eine wichtige Rolle bei der Schwangerschaft und der Entwicklung des Fötus. Um ihre Beteiligung zu verstehen, ist es entscheidend, die Konzentrationen von Tryptophan (TRP), Kynurenin (KYN) und Kynurensäure (KYNA) in relevanten biologischen Proben wie der Plazenta, den fetalen Membranen und der Nabelschnur zu quantifizieren. Diese Studie verwendete Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), um die TRP-, KYN- und KYNA-Spiegel zu bestimmen. Die LC-MS/MS-Methode wurde für hohe Sensitivität und Spezifität optimiert und zeigte eine gute Reproduzierbarkeit mit einer Präzision von < 10 % CV und einer Genauigkeit von 85–115 %. Die untere Bestimmungsgrenze für TRP und KYN lag bei 0,5 µg/ml, während sie für KYNA bei 0,5 ng/ml lag. Die Methode zeigte Linearität innerhalb des untersuchten Konzentrationsbereichs im Homogenat, der von 0,5 bis 30 µg/ml für TRP und KYN und von 0,5 bis 25 ng/ml für KYNA reichte. Mit dieser Methode fanden wir signifikante Unterschiede in den Konzentrationen dieser Substanzen in den untersuchten mütterlich-fetalen Kompartimenten. Plazentaproben zeigten höhere KYN- und niedrigere KYNA-Konzentrationen als die Nabelschnur und die fetale Membran, was auf eine möglicherweise wichtige Rolle von Kynureninen in der Spätschwangerschaft hinweist. Insgesamt könnte dieser Befund die weitere Forschung erleichtern und Aufschluss über die Beteiligung des Kynurenin-Signalwegs des TRP-Stoffwechsels an der fetalen Entwicklung geben.

L-Tryptophan (TRP) ist eine essentielle Aminosäure, die hauptsächlich über den Kynurenin-Weg (KP)1 verstoffwechselt wird. Unter normalen Bedingungen wird TRP durch die hepatische Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TDO-2) und die extrahepatische Indoleamin-2,3-Dioxygenase (IDO)-1 und IDO-22,3 umgewandelt. Diese Enzyme katalysieren die Umwandlung von TRP in N-Formyl-Kynurenin, das weiter zu L-Kynurenin (KYN) und seinen nachgeschalteten Metaboliten metabolisiert werden kann, was letztendlich zur Bildung von Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+)4 führt.

Das KP ermöglicht die Bildung vieler Metaboliten mit unterschiedlichen Funktionen, einschließlich der Modulation von Immunität5,6 und Entzündungen7,8. Darüber hinaus spielen diese Metaboliten eine entscheidende Rolle in der Stressphysiologie, da Alltagsstressoren die Produktion von TRP-Abbaumetaboliten beeinflussen können9. Einer dieser Metaboliten ist KYN, ein Agonist des Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptors (AhR)10. Dieser Rezeptor wird überall im menschlichen Gewebe exprimiert und ist an vielen Stoffwechselfunktionen beteiligt. Seine Aktivierung spielt jedoch auch eine wesentliche Rolle bei pathologischen Prozessen, einschließlich Entzündungen und Karzinogenese11,12. KYN dient als Vorläufer von Kynurensäure (KYNA), einem endogenen Antagonisten von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und Alpha7-Nikotin-Acetylcholin-Rezeptoren, der an Entzündungen13 beteiligt ist und umfassend auf seine Rolle bei verschiedenen Erkrankungen des zentralen Nervensystems untersucht wird Nervensystem (ZNS)14,15,16. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass KYNA ein Agonist des G-Protein-gekoppelten Rezeptors 35 (GPR35)17 und AhR10 ist. KYNA dient auch als Biomarker, der direkt mit Stressereignissen korreliert9,18. Tiermodelle haben beispielsweise gezeigt, dass Stress die KYNA-Konzentration im Organismus mit der Zeit erhöht, was zu einer generalisierten biologischen KYNA-abhängigen Stressreaktion führt18,19.

Darüber hinaus ist das KP an vielen physiologischen Prozessen beteiligt und spielt eine wesentliche Rolle in der Schwangerschaft, indem es die Gefäß- und Immuntoleranz der Plazenta reguliert und für Neuroprotektion sorgt1,2,20,21. Beispielsweise wurde die funktionelle Rolle von IDO bei der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft in der Plazenta von Säugetieren in vivo nachgewiesen, wo die Hemmung von IDO bei Mäusen zum Verlust der Schwangerschaft führte22. Darüber hinaus sorgt TDO, ein weiteres Schlüsselenzym im Hauptabbauweg von TRP, für die Aufrechterhaltung der fetalen und mütterlichen Immuntoleranz23.

In Bezug auf Schwangerschaft und Plazentagewebe kann KYN die Plazenta und die fetale Blut-Hirn-Schranke passieren. Eine einzelne orale Verabreichung von KYN an trächtige Mäusemütter erhöhte die KYN-Spiegel im fötalen Plasma und im Gehirn24. In Tierversuchen führte die kontinuierliche KYN-Supplementierung bei Muttertieren zu Gedächtnisstörungen bei erwachsenen Nachkommen von Tieren, denen KYN in der prä- und postnatalen Phase verabreicht wurde24,25. Es wurde gezeigt, dass KYNA eine wesentliche Rolle beim Wachstum des Fötus spielt, insbesondere bei der Entwicklung des ZNS in der Gebärmutter, wie Notarangelo und Schwarcz26 gezeigt haben. Da die Plazenta ein lebenswichtiges Organ in der Entwicklung des Fötus ist und als Hauptquelle für Nährstoffe und Sauerstoff für den sich entwickelnden Fötus dient, besteht ein wachsendes Interesse daran, die peripheren Funktionen von KYNA in der Physiologie des Plazentagewebes zu verstehen. Trotz seiner entscheidenden Rolle in peripheren Geweben ist die Regulation von KYNA in der Plazenta noch wenig verstanden. TRP ist eine Aminosäure, die für die Proteinsynthese benötigt wird und eine Vorstufe ist, die zusammen mit Serotonin und KPs verstoffwechselt wird. Interessanterweise wurde vor einigen Jahren gezeigt, dass TRP ein Agonist der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPR) 13927 und GPR14228 ist. Daten über die Rolle dieser Rezeptoren sind derzeit bemerkenswert rar. Wenn das Vorhandensein dieser Rezeptoren in schwangerschaftsassoziierten Geweben bestätigt wird, wird die Messung des TRP-Spiegels eine neue Bedeutung erlangen. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Konzentrationen von TRP, KYN und KYNA zu untersuchen, indem eine validierte Methode für deren Quantifizierung in menschlichen Plazenta-, Fötalmembran- und Nabelschnurproben unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vorgestellt wird. Diese Methode bietet ein zuverlässiges und empfindliches Werkzeug zur Untersuchung von TRP, KYN und KYNA in Plazentaproben. Es könnte wertvolle Einblicke in die Regulierung des Gehalts dieser Moleküle in der Plazenta und ihre möglichen Auswirkungen auf die Entwicklung des Fötus liefern.

In diese Studie wurden Plazenta von 9 gesunden schwangeren Frauen im Alter von 22 bis 37 Jahren (Median: 34, IQR: 4) einbezogen, und die Schwangerschaftswochen reichten von 37 Wochen und 0 Tagen bis 40 Wochen und 6 Tagen (Median: 38 Wochen und eine). Tag; IQR-Gestationswochen = 1 und IQR-Gestationstage = 4). Während oder nach der Geburt wurden keine medizinischen Komplikationen oder Infektionen gemeldet.

Wie in unseren Methoden beschrieben wurde eine LC-MS/MS-Chromatographie durchgeführt, um die Konzentration von TRP, KYN und KYNA in den Gewebeproben der mütterlichen Plazenta, der Nabelschnur und der fötalen Membran zu messen. Die Retentionszeiten für TRP, KYN und KYNA in den drei Proben betrugen weniger als 4 Minuten. Die Chromatogramme für die drei Gewebeproben sind in den Abbildungen dargestellt. 1 und 2. Die Analyten zeigten eine ausgezeichnete Linearität mit Regressionskoeffizienten (R2) von mehr als 0,99, einer Präzision von weniger als 10 % VK und einer Genauigkeit von 85–115 % (Abb. S1). Die unterste Quantifizierungsgrenze (LLOQ) betrug 0,5 µg/ml für TRP und KYN und 0,5 ng/ml für KYNA. Die Konzentrationen in den zur Kalibrierung verwendeten Homogenaten betrugen 0,5–30 µg/ml für TRP und KYN und 0,5–25 ng/ml für KYNA. Immer wenn das Signal den Bereich überschritt, verdünnten wir die Proben vor der Verarbeitung oder passten das Injektionsvolumen an, um innerhalb des Bereichs der Methodenlinearität zu bleiben. Die TRP-, KYN- und KYNA-Konzentrationen wurden mittels LC-MS/MS quantifiziert (Abb. 3, S2, S3 und S4). Zunächst bestimmten wir die Menge an TRP in Plazenta-, Nabelschnur- und fötalen Membrangeweben. Die Konzentrationen variierten zwischen den Proben, wobei die höchste Konzentration im fötalen Membrangewebe (3,63 ± 1,34 µg/ml) gefunden wurde, gefolgt von Nabelschnurgewebe (2,80 ± 0,20 µg/ml) und mütterlicher Plazenta (1,35 ± 0,35 µg/ml). Der Unterschied zwischen Plazenta und Nabelschnur schien statistisch signifikant zu sein. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen der fetalen Membran, der mütterlichen Plazenta und der Nabelschnur festgestellt, was wahrscheinlich auf die hohe Variabilität der Messungen innerhalb der Gruppe zurückzuführen ist (Abb. 3A). Die KYN-Konzentrationen variierten zwischen den Proben. Die höchste Konzentration wurde in mütterlichen Plazentagewebeproben (62,89 ± 6,35 µg/ml) gefunden, gefolgt von fötalen Membranproben (13,59 ± 5,30 µg/ml) und Nabelschnurproben (2,20 ± 0,54 µg/ml). Sowohl im Nabelschnur- als auch im fötalen Membrangewebe waren die KYN-Werte signifikant niedriger als in der mütterlichen Plazenta (Abb. 3B). Die KYNA-Konzentrationen waren in der fetalen Membran höher (26,30 ± 3,80 ng/ml), gefolgt von Nabelschnurgewebe (18,08 ± 2,30 ng/ml) und mütterlichen Plazentaproben (2,58 ± 0,32 ng/ml). In der Plazenta waren die KYNA-Spiegel signifikant niedriger als in der Nabelschnur und im fötalen Membrangewebe (Abb. 3C). Bemerkenswert ist der beträchtliche Gradient zwischen den Konzentrationen der untersuchten Substanzen in den untersuchten mütterlich-fetalen Kompartimenten, der insbesondere für KYN und KYNA deutlich wird (Abb. 3D).

Mehrfachreaktionsüberwachung von Tryptophan (TRP), Kynurenin (KYN) und Kynurensäure (KYNA). Analyten sind in Blau, isotopenmarkierte Standards in Rot dargestellt. Verbindungen: Tryptophan (überwachtes MRM: 205,1 → 118, 205,1 → 146), [13C11, 15N2]-Tryptophan (überwachtes MRM: 218,1 → 127, 218,1 → 156), L-Kynurenin (überwachtes MRM: 209,1 → 94, 209,1 → 146). ) und [13C6]-Kynurenin (überwachtes MRM: 215 → 100, 215 → 152), Kynurensäure (überwachtes MRM: 190 → 116, 190 → 144), [2H5]-Kynurensäure (überwachtes MRM: 195,1 → 121, 195,1). → 149).

Repräsentative MRM-Chromatogramme für die Proben der mütterlichen Plazenta (A), der fetalen Membran (B) und der Nabelschnur (C). In Pink: Kynurenin (Retentionszeit 1,45 Min.). In Grün: Tryptophan (Retentionszeit 2,78 min). In Blau: Kynurensäure (Retentionszeit 3,43 min).

Konzentration von Tryptophan (A), Kynurenin (B), Kynurensäure (C) in der mütterlichen Plazenta (MP), der Nabelschnur (UC) und der fetalen Membran (FM) sowie interkompartimenteller Konzentrationsgradient (D). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, Anzahl der Probanden = 9 pro Gruppe (A–C). Der interkompartimentale Gradient wurde als Verhältnis des Nabelschnur- oder Fötalmembrangehalts der untersuchten Substanz zum Plazentagehalt berechnet (angenommen als 1). *p < 0,05, ***p < 0,001 im Vergleich zu den angegebenen Gruppen. Ein nichtparametrischer Kruskal-Wallis-Test zeigte einen statistischen Unterschied in der TRP-Konzentration zwischen mindestens zwei Geweben (p = 0,031). Dunns mehrfache Vergleiche zeigten einen geringeren TRP-Gehalt bei MP im Vergleich zu UC (p < 0,05). Ein nichtparametrischer Kruskal-Wallis-Test zeigte einen statistischen Unterschied in der KYN-Konzentration zwischen mindestens zwei Geweben (p < 0,001). Dunns Mehrfachvergleichstest ergab einen geringeren KYN-Gehalt sowohl bei UC (p < 0,001) als auch bei FM (p < 0,05) im Vergleich zu MP. Die einfaktorielle ANOVA-Analyse ergab einen statistischen Unterschied in der KYNA-Konzentration zwischen mindestens zwei Geweben (p < 0,001). Tukeys mehrfache Vergleichstests zeigten, dass die mittlere KYNA-Konzentration bei UC (p < 0,001) und FM (p < 0,001) im Vergleich zu MP signifikant höher war.

Basierend auf diesen Messungen wurden KYN/TRP- und KYNA/KYN-Verhältnisse berechnet, die die Aktivität der IDO- bzw. KAT-Enzyme widerspiegeln. Das KYNA/TRP-Verhältnis wurde ebenfalls berechnet. In der menschlichen Plazenta ermittelten wir ein signifikant höheres KYN/TRP-Verhältnis (7755,2 ± 1838,4) im Vergleich zur Nabelschnur (77,5 ± 16,47) und der fetalen Membran (1777,0 ± 1035,2) (Abb. 4A und S5). Das KYNA/KYN-Verhältnis war in der Nabelschnur (0,0120 ± 0,0031) signifikant höher als in der Plazenta (0,000046 ± 0,000009) und der fetalen Membran (0,0044 ± 0,0011) (Abb. 4B und S6). Das KYNA/TRP-Verhältnis war in der fetalen Membran (0,0251 ± 0,0116) höher als in der mütterlichen Plazenta (0,0037 ± 0,0011) und der Nabelschnur (0,0067 ± 0,0009) (Abb. 4C und S7).

Kynurenin/Tryptophan-Verhältnis (A), Kynurensäure/Kynurenin-Verhältnis (B) und Kynurensäure/Tryptophan-Verhältnis (C) in der mütterlichen Plazenta (MP), der Nabelschnur (UC) und der fetalen Membran (FM). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, eine Anzahl von Probanden = 9 pro Gruppe. *p < 0,05, ***p < 0,001 im Vergleich zu UC/FM. FM-fetale Membran, KYN-Kynurenin, KYNA-Kynurensäure, MP-mütterliche Plazenta, TRP-Tryptophan, UC-Nabelschnur. Ein nichtparametrischer Kruskal-Wallis-Test zeigte einen statistischen Unterschied im KYN/TRP-Verhältnis zwischen mindestens zwei Geweben (p = 0,001). Dunns Mehrfachvergleichstest zeigte ein höheres KYN/TRP-Verhältnis bei MP im Vergleich zu UC (p < 0,001). Die Analyse der einfaktoriellen ANOVA ergab einen statistisch signifikanten Unterschied im KYNA/KYN-Verhältnis zwischen mindestens zwei Geweben (p = 0,001). Der Mehrfachvergleichstest von Tukey ergab, dass das KYNA/KYN-Verhältnis bei UC im Vergleich zu MP (p < 0,001) und bei UC im Vergleich zu FM (p < 0,05) signifikant höher war. Ein nichtparametrischer Kruskal-Wallis-Test zeigte einen statistischen Unterschied im KYNA/TRP-Verhältnis zwischen mindestens zwei Geweben (p = 0,049). Dunns Mehrfachvergleichstest zeigte ein höheres KYNA/TRP-Verhältnis bei FM (p < 0,05) als bei MP.

Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die die TRP-, KYN- und KYNA-Konzentrationen in mütterlichen Plazenta-, Fötalmembran- und Nabelschnurgewebeproben schwangerer Frauen mittels LC-MS/MS vergleicht. Obwohl bekannt ist, dass KYN und seine Metaboliten eine Rolle bei der Entwicklung des Fötus spielen, fehlen Studien, die TRP- und KP-Metaboliten in diesen Geweben untersuchen. Die meisten Forscher messen den Gehalt an Substanzen im Blut, wohingegen es von entscheidender Bedeutung ist, den Gehalt der Substanzen im Gewebe zu kennen, wo sich ihre potenziellen molekularen Angriffspunkte befinden.

Dieser Bericht ergab deutlich niedrigere KYNA-Konzentrationen, aber höhere KYN-Konzentrationen in der mütterlichen Plazenta im Vergleich zu den anderen getesteten Geweben. TRP war in der Plazenta niedriger als in der Nabelschnur. Darüber hinaus wies die mütterliche Plazenta ein signifikant höheres KYN/TRP-Verhältnis auf als die Nabelschnur. Andererseits war das KYNA/KYN-Verhältnis in der Nabelschnur signifikant höher als in der mütterlichen Plazenta oder der fetalen Membran. Das KYNA/TRP-Verhältnis war in der Plazenta niedriger als in der fetalen Membran.

Was die technischen Aspekte der Analysemethode zur Beurteilung von TRP, KYN und KYNA angeht, erreichten wir eine Genauigkeit von 85–115 % und eine Präzision von < 10 % CV, mit einem akzeptablen LLOQ (0,5 µg/ml für TRP und KYN und). 0,5 ng/ml für KYNA) und Linearität über den untersuchten Konzentrationsbereich. Die Untersuchung dieser Methode erfüllt die Kriterien für bioanalytische Methoden und unsere Ergebnisse ähnelten denen früherer Studien zur Analyse von Kynureninen im Serum (Hu et al.29: < 10 % CV; LLOQ: 1 µg/ml für TRP, 100 ng/ml für KYN und 1 ng/ml für KYNA; van Zundert et al.30: < 13 % CV; LLOQ: 0,01 µmol/L für KYN und 0,04 µmol/L für TRP); Allerdings gibt es keine Studien, die Kynurenine im Plazentagewebe mittels LC/MS untersuchen.

Unsere Studie ergab sieben- bzw. zehnfach niedrigere KYNA-Konzentrationen in mütterlichen Plazentaproben als in den anderen beiden analysierten Gewebeproben, nämlich der Nabelschnur und der fetalen Membran. Die deutlich geringere KYNA-Konzentration in mütterlichen Plazentaproben könnte physiologische Bedeutung haben. Es wurde gezeigt, dass KYNA die Plazentaschranke zwischen Mutter und Fötus nicht passiert, wie bei trächtigen Mäusen nachgewiesen wurde31. Es wurde jedoch über eine KYNA-Konzentration von bis zu 1,13 μM im menschlichen Fruchtwasser im letzten Trimester berichtet32. Dieses Phänomen könnte darauf hindeuten, dass beide Kompartimente isoliert sind und die KYNA-Produktion im Fötus unabhängig von der mütterlichen Plasmakonzentration erfolgt. Tatsächlich ergab eine an Gewebeschnitten von Mäusen durchgeführte Studie, dass das fötale Gehirn möglicherweise drei- bis viermal mehr KYNA produziert als das mütterliche Gehirn und die Plazenta, jedoch weniger als die mütterliche und fötale Leber33. Es wurde jedoch auch vermutet, dass erhöhte KYNA-Spiegel in der Plazenta mit mütterlichen pathologischen Zuständen wie Präeklampsie und einer abnormalen fetalen Entwicklung, einschließlich eingeschränktem fetalem Wachstum und beeinträchtigter Gehirnentwicklung, zusammenhängen26. Zukünftige Studien sollten die Bewertung der KYNA-Konzentrationen unter medizinischen oder psychologischen Bedingungen wie Depressionen oder perinatalem psychischen Stress in Betracht ziehen, da KYNA auch eine Rolle bei der Gehirnentwicklung spielen könnte26 und sein Anstieg mit Stress zusammenhängt26.

Hier zeigen wir einen 5- bzw. 25-fachen Anstieg der KYN-Konzentration in der mütterlichen Plazenta im Vergleich zur fetalen Membran bzw. zum Nabelschnurgewebe. Diese ausgeprägte Kompartimentierung von KYN weist auf seine lokale hohe physiologische Bedeutung hin. Mechanistisch gesehen ist dies ein unerwartetes Phänomen, da KYN leicht über biologische Barrieren transportiert werden kann. Daher ist die zugrunde liegende Ursache vermutlich die lokale KYN-Produktion. Tatsächlich haben frühere Studien gezeigt, dass erhöhte IDO-Spiegel zu einer enzymatischen Aktivität führten, die zu einem Anstieg der KYN-Konzentration im Plazentagewebe führte34. Es wurde auch gezeigt, dass die KYN-Produktion im ersten Trimester beginnt, wie in einer Ex-vivo-Studie mit Plazentazellkulturen gezeigt wurde35. Am Ende der Schwangerschaft ist die Entwicklung des Endothelsystems in der Plazenta für einen Anstieg der KYN-Konzentration aufgrund einer höheren IDO-Enzymaktivität verantwortlich34. Unsere Berechnung des KYN/TRP-Verhältnisses, ein Ersatz für die IDO-Aktivität, zeigte eine erhöhte Aktivität dieses Enzyms in den mütterlichen Plazentaproben, was mit früheren Studien übereinstimmt1,34. Darüber hinaus ist bekannt, dass dieses Enzym im Synzytiotrophoblasten lokalisiert ist34,36 und ab der 14. Schwangerschaftswoche in der menschlichen Plazenta1 zunimmt und bis zum Ende der Schwangerschaft höhere Konzentrationen erreicht34. Karahoda und Kollegen berichteten auch über eine signifikante IDO-Enzymexpression und -aktivität in termingerechten Plazenten34,37. Unsere Studie steht im Einklang mit früheren Untersuchungen, da wir im Vergleich zu den Nabelschnurproben ein erhöhtes KYN/TRP-Verhältnis in der Plazenta fanden. Darüber hinaus stimmen unsere Ergebnisse mit denen anderer Studien überein, die die entscheidende Rolle von TDO/IDO für die Aufrechterhaltung einer Schwangerschaft hervorheben22,23. Unsere Studie präsentierte die IDO-Schätzung, berechnet nach der Formel [KYN]/[TRP]. Dieses Verhältnis wurde verwendet, um Veränderungen der IDO-Aktivität in isolierten Geweben oder Kulturmedien auszudrücken38,39,40. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Indikator die Enzymaktivität in vivo nicht streng beurteilt, da relevante physiologische Bedingungen nicht berücksichtigt werden. Stattdessen handelt es sich bei dem in unserer Studie verwendeten KYN/TRP-Verhältnis um einen einfach zu berechnenden diagnostischen Index, der den tatsächlichen Gehalt beider Substanzen darstellt, also die Summe aus Zufuhr, Metabolismus und Ausscheidung von TRP und KYN.

Andere Verhältnisse, wie das KYNA/KYN-Verhältnis und das KYNA/TRP-Verhältnis, zeigen dynamische Veränderungen im Anteil der KP-Metaboliten in verschiedenen Geweben. Unsere Studie ergab ein erhöhtes KYNA/KYN-Verhältnis, ein Ersatz für die Aktivität der Kynurenin-Aminotransferase (KAT), im Nabelschnurgewebe, jedoch nicht in den mütterlichen Plazenta- oder fötalen Membranproben. Eine mögliche Erklärung für diesen Befund ist der erhöhte Aminosäurestoffwechsel der mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur, der für deren biologische Funktion und Proliferation wesentlich ist41. Die Studie von Wang und Kollegen berichtete über eine hohe Expression des KAT II-Isoenzyms in den mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur, das die Umwandlung von KYN in KYNA42 katalysiert. Daher kann das in unserer Studie in der Nabelschnurgewebeprobe beobachtete höhere KYNA/KYN-Verhältnis auf die mesenchymalen Stammzellen zurückgeführt werden. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen und die KAT-Aktivität und ihre Ausprägung zwischen normalen Schwangerschaften und pathologischen Zuständen oder Funktionsstörungen wie Präeklampsie oder perinatalem psychischem Stress der Mutter zu vergleichen. Schließlich finden wir einen signifikanten Unterschied im KYNA/TRP-Verhältnis, einem Marker für die Eliminierung/Ausscheidung von Kynurenin-Metaboliten, die auf eine Nierenerkrankung hinweisen43, zwischen der Plazenta und der fetalen Membran, jedoch nicht zwischen Nabelschnurproben. Die Erklärung für dieses Phänomen muss durch weitere Forschung untermauert werden. Wir spekulieren, dass unter physiologischen Umständen im Plazentasystem ein Gleichgewicht hinsichtlich der Ausscheidung von Kynurenin-Metaboliten bestehen könnte. Daher wäre es interessant, die Ausscheidung von Kynurenin-Metaboliten zwischen gesunden schwangeren Teilnehmerinnen und solchen mit Erkrankungen wie Präeklampsie oder perinataler Depression zu vergleichen.

Obwohl unsere Ergebnisse die Machbarkeit der Verwendung von LC-MS/MS zur Quantifizierung von TRP und anderen Tryptophan-Metaboliten in Proben der mütterlichen Plazenta, der fetalen Membran und der Nabelschnur bestätigen, sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Dazu gehören die geringe Probengröße, der fehlende Vergleich mit Geweben von Patienten mit Erkrankungen wie Präeklampsie, perinataler Depression oder perinatalem psychischem Stress sowie das Fehlen von Nabelblut- oder mütterlichen Blutproben für weitere Vergleiche. Aufgrund der Einwilligungsbedingungen der Ethikkommission wurden keine personenbezogenen Daten erhoben. Daher umfasst unsere Analyse nicht zahlreiche Aufzeichnungen, einschließlich Anästhesie und der Verwendung anderer Medikamente während einer elektiven Kaiserschnittentbindung. Auch technische Aspekte wie die Grenze der Quantifizierung und des Analysedurchsatzes sollten als Einschränkungen betrachtet werden. Wenn die Konzentrationen der untersuchten Metaboliten zu niedrig sind, muss die Empfindlichkeit des Tests erhöht werden. Um den Analysedurchsatz zu erhöhen, kann eine automatisierte Probenvorbereitung in Betracht gezogen werden. Für kleine Probenzahlen ist dieser Durchsatz jedoch zufriedenstellend. Eine weitere Einschränkung dieser Studie war das Fehlen eines Vergleichs mit genetischem Material zur Analyse der Produktion von Enzymen im Zusammenhang mit dem TRP-Abbau oder einer immunhistologischen Bewertung der Rezeptoren, auf die KYNA und andere TRP-Metaboliten in unserer Studie abzielen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass TRP und seine Metaboliten in fetoplazentaren Geweben zuverlässig messbar sind. Wir haben eine hochempfindliche und spezifische LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von TRP, KYN und KYNA in menschlichen Plazenta- und Nabelschnurproben entwickelt. Die Methode zeigte eine gute Reproduzierbarkeit mit einer CV-Präzision von < 10 % und einer Genauigkeit von 85–115 %. Diese Studie unterstreicht die Bedeutung einer präzisen TRP-, KYN- und KYNA-Quantifizierung in biologischen Proben und die mögliche Anwendung dieser Methode in zukünftigen Studien, die die Beteiligung des KP an der fetalen Entwicklung untersuchen. Darüber hinaus fanden wir mit dieser Methode in Material, das bei Kaiserschnitten bei gesunden Frauen gesammelt wurde, ein hohes KYNA/KYN-Verhältnis in der Nabelschnur, hohe KYN-Konzentrationen und ein KYN/TRP-Verhältnis, aber niedrige KYNA-Konzentrationen in der mütterlichen Plazenta.

Zukünftige Studien könnten den Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Kynureninen und verschiedenen plazentaren und fetalen Merkmalen wie Gestationsalter, Geburtsgewicht und mütterlicher Gesundheit untersuchen. Angesichts des höheren KYN-Gehalts in der mütterlichen Plazenta und des höheren KYNA-Gehalts im fetalen Kompartiment sowie der vielfältigen biologischen Wirkungen von KYN und KYNA könnten weitere Untersuchungen ihrer Rolle in der Plazenta, einschließlich Synthese, Stoffwechsel und Regulierung, zur Erklärung beitragen ihre Bedeutung für die fetale Entwicklung. Unsere Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für zukünftige Studien dar, um die Rolle von TRP und Kynureninen für die Gesundheit von Plazenta und Fötus sowie für medizinische oder psychologische Erkrankungen (z. B. perinatale Depression oder perinataler psychischer Stress) während der Schwangerschaft zu verstehen.

Im Folgenden handelt es sich um eine methodenbasierte Forschungsstudie mit einer kleinen Stichprobe menschlicher Plazentaproben, die anonym aus der Abteilung für Geburtshilfe des Universitätsklinikums Mannheim entnommen wurden. Ziel dieser Forschung war die Analyse der Konzentrationen von TRP, KYN und KYNA. Darüber hinaus untersuchten wir das KYN/TRP-Verhältnis (das die IDO-Aktivität widerspiegelt), das KYNA/KYN-Verhältnis (das die KAT-Aktivität widerspiegelt) und das KYNA/TRP-Verhältnis der menschlichen Plazenta, der fetalen Membranen und der Nabelschnurproben. Da die Proben anonym entnommen wurden, gab es keinen Kontakt zu den Teilnehmerinnen und die Hebammen gaben Auskunft über Alter und Schwangerschaftszeit. Der Studienarzt hatte keinen Kontakt zu den Teilnehmern. Schließlich wurde diese Studie im Einklang mit der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg (2022-574) genehmigt.

Terminplazenten (n = 9) wurden nach einer elektiven Kaiserschnittentbindung zwischen der 38. und 40. Schwangerschaftswoche gesammelt. Alle Teilnehmer, die sich einer Kaiserschnittentbindung unterzogen, waren medizinisch stabil, hatten keine gesundheitlichen Probleme, waren für den chirurgischen Eingriff vorgesehen, hatten bereits Erfahrung mit Kaiserschnittentbindungen und hatten keine medizinischen oder Notfallindikationen. Unmittelbar nach der Geburt wurden Proben von mütterlichen Plazenten, fetalen Membranen und Nabelschnüren entnommen und präpariert. Mütterliche Plazenten von Patienten, die sich einer Notfallbehandlung unterzogen hatten und schwer erkrankt waren oder an medizinischen oder geburtshilflichen Erkrankungen (einschließlich fetalem Tod) litten, wurden von der Studie ausgeschlossen.

Nach der Präparation der Plazentastruktur wurden die biologischen Proben sofort in Trockeneis gelagert und zur Lagerung in einer Forschungseinrichtung am Zentralinstitut für Seelische Gesundheit in Mannheim (Deutschland) transportiert. Die Proben wurden in Trockeneis zur weiteren Analyse an die Forschungseinrichtung der Abteilung für Bioanalytik der Universität Lublin, Polen, geschickt.

Die analytisch mit stabilen Isotopen markierten Standards von TRP [13C11, 15N2], KYN [13C6] und KYNA [2H5] wurden von Alsachim (Illkirch-Graffenstaden, Frankreich) erworben. Acetonitril und Methanol der Optima® LC/MS-Qualität wurden von Fisher Chemical (Waltham, MA, USA) zur Verwendung in LC/MS-Analysen bezogen. Ameisensäure (LC/MS-Qualität) und Ethanol (LC/MS-Qualität) wurden von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Reinstwasser wurde aus dem Millipore Direct-Q3-UV-Reinigungssystem (Merck KGaA, Deutschland) gewonnen. Titan-Spritzenfilter RC, 0,2 μm, wurden von Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) geliefert.

Analytische, mit stabilen Isotopen markierte Standards von TRP [13C11, 15N2], KYN [13C6] und KYNA [2H5] wurden als Stammlösungen in einer Konzentration von 1000 mg/L gemäß den Spezifikationen hergestellt. Arbeitslösungen mit internem Standard wurden in Methanol hergestellt.

Zur Probenvorbereitung wurden Plazenten, fetale Membranen und Nabelschnüre von Probanden nach einem Kaiserschnitt entnommen und bei –80 °C gelagert. 0,2 g jeder Probe wurden in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff eingewogen und in hochreinem Wasser (1:3 w/v) unter Verwendung eines Laborkugelhomogenisators (Bead Mill MAX, VWR, Teil von Avantor, Radnor PA, USA) homogenisiert. Die Desintegration wurde mit Keramikkügelchen mit 2,8 mm Durchmesser bei 6 m/s während eines Zyklus von 30 s durchgeführt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 20.598 × g und 4 °C wurden 25 µL der Arbeitslösung isotopenmarkierter interner Standards: TRP [13C11, 15N2], KYN [13C6] und KYNA [2H5] zu 200 µL hinzugefügt homogenisierte Suspension. Die Proben wurden 5 Minuten lang mit 575 µL gekühltem Methanol/Ethanol (1:1 v/v) gevortext, 15 Minuten lang bei –20 °C gehalten und dann 10 Minuten lang zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt, Methanol wurde zugegeben (1:1 w/v) und die Proben wurden gevortext und 60 Minuten lang bei –20 °C gehalten, bevor sie 20 Minuten lang bei 12.100 × g bei 4 zentrifugiert wurden °C. Die Überstände wurden mit hochreinem Wasser verdünnt (1:1 w/v) und durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter in Autosampler-Fläschchen filtriert.

Die Bestimmung von TRP, KYN und KYNA wurde mit einem Flüssigkeitschromatographen der Serie 1290 Infinity II von Agilent Technology durchgeführt, der mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer 6475 QQQ LC/MS von Agilent Technologies gekoppelt war, das mit einer Jet Stream-Ionenquelle ausgestattet war. Die Chromatographie wurde auf einer Zorbax Extend C18 RRHD-Säule (2,1 × 100 mm, 1,8 µm) mit einer Zorbax Eclipse Plus C18 UHPLC-Vorsäule (2,1 × 5 mm, 1,8 µm) und einem Gradienten von 0,1 % Ameisensäure in Wasser durchgeführt 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–1 Min., 3 % B; 1–8 Min., 3–35 % B; 8–8,01 Min., 35–95 % B; 8,01–11 Min., 95 % B, und dann 3 Min. Säulenkonditionierung bei 3 % B. Die Säule und der Autosampler wurden bei 40 °C bzw. 10 °C gehalten. Das LC/QQQ-Instrument wurde im positiven Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI) und im Scan-Typ Dynamic Multiple Reaction Monitoring (dMRM) betrieben. Die Parameter der MS-Ionenquelle wurden wie folgt eingestellt: Trocknungsgastemperatur 250 °C; Trocknungsgasfluss 11 l/min; Verneblerdruck 45 psi; Hüllgastemperatur 200 °C; Hüllgasfluss 6 l/min und Kapillarspannung 2750 V. MRM-Übergänge, Kollisionsenergien (CE) und Fragment oder Spannungen für alle Zielverbindungen sind in Tabelle 1 und Abb. 1 dargestellt. Zur Steuerung wurde die Agilent Mass Hunter Data Acquisition-Software verwendet Für die Datenverarbeitung wurden Geräte, Mass Hunter Quantitative QQQ Analysis B.10.2 und die Qualitative Analysis-Software B.10.00 eingesetzt.

Das KYN/TRP-Verhältnis, das die IDO-Aktivität repräsentiert, wurde mit der folgenden Formel berechnet: [KYN]/[TRP]. Das KYNA/KYN-Verhältnis, das die enzymatische Umwandlung von KYN zu KYNA darstellt (als KAT-Aktivität betrachtet), wurde nach der folgenden Formel berechnet: [KYNA]/[KYN]. Schließlich nutzten wir die erhaltenen Daten zur Berechnung des KYNA/TRP-Verhältnisses, das als Biomarker zur Bewertung der Ausscheidung von Metaboliten im KP43 dient.

Alle numerischen Variablen wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM-) dargestellt. Daten, die einer Gaußschen Verteilung folgten, wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA ausgewertet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen Gruppen zu bewerten. Der Tukey-Test für Mehrfachvergleiche wurde als Post-hoc-Analyse verwendet, wenn ein signifikanter Unterschied festgestellt wurde. Daten mit einer nicht-Gauß-Verteilung wurden mithilfe der Kruskal-Wallis-Methode (nichtparametrische ANOVA) ausgewertet, gefolgt von einem Post-hoc-Dunn-Mehrfachvergleichstest, wenn ein signifikanter Unterschied festgestellt wurde. Für diese Unterschiede wurden angepasste p-Werte berechnet. Diese Studie definierte die statistische Signifikanz immer dann, wenn der zweiseitige p-Wert kleiner oder gleich 0,05 war. Für die statistischen Analysen und die deskriptiven Daten verwendeten wir die R-basierte Software jamovi 2.0.044. Die Grafiken wurden mit Prism 8 GraphPad (GraphPad Software Inc., Kalifornien, Vereinigte Staaten von Amerika) erstellt.

Da die Proben anonym entnommen wurden, gab es keinen Kontakt zu den Teilnehmerinnen und die Hebammen gaben Auskunft über Alter und Schwangerschaftsdauer. Der Studienarzt hatte keinen Kontakt zu den Teilnehmern. Da wir ausschließlich anonymisierte Patientendaten verwendeten, war eine individuelle Einwilligung des Patienten weder erforderlich noch möglich. Das Studienprotokoll und alle Studienabläufe wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim überprüft und genehmigt. . Darüber hinaus wurde diese Machbarkeitsstudie in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Helsinki-Erklärung für nicht identifizierbare Proben durchgeführt. Darüber hinaus hielt es an den Definitionen für nicht identifizierbare biologische Materialien fest, die vom Ministerkomitee des Europarates an die Mitgliedstaaten zur Forschung an biologischen Materialien menschlichen Ursprungs (958. Treffen der Ministervertreter) festgelegt wurden.

Bezüglich der Einwilligung nach Aufklärung möchten wir klarstellen, dass es zu keinem Kontakt mit den Teilnehmern kam, da die Proben anonym und somit nicht identifizierbar waren. Die Studienärztin entnahm unmittelbar nach der Geburt frische Plazenten aus dem Behandlungs- und Laborraum der Klinik für Geburtshilfe des Universitätsklinikums Mannheim. Die Hebammen machten Angaben zu Alter und Schwangerschaftszeit ohne Namen oder andere identifizierbare Daten. Der Studienarzt hatte keinen Kontakt zu den Teilnehmern. Da wir nur anonymisierte Patientendaten verwendeten und keine genetische Analyse der Plazentaproben durchführten, war eine individuelle Einwilligung des Patienten weder erforderlich noch möglich. Diese Stellungnahme und das Studienprotokoll wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim genehmigt, die auf die Notwendigkeit einer Einwilligung nach Aufklärung verzichtete. Die Ethikkommission II der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg (Medizinische Fakultät Mannheim) hat das Forschungsvorhaben (574-22) aus ethischer und rechtlicher Sicht geprüft und keine Bedenken hinsichtlich der Umsetzung geäußert. Da Biomaterial, das aus Restmaterial gewonnen wird, als pseudonym gilt, hat die Ethikkommission die Studie ohne Einwilligung nach Aufklärung genehmigt, da keine genetischen Analysen durchgeführt und keine personenbezogenen Daten verwendet werden. Folglich war es verboten, den Organspender zu kontaktieren oder auf Krankenakten für Medikamente oder patientenbezogene Informationen zuzugreifen. Darüber hinaus schränkte die Ethikkommission den Kontakt zwischen Teilnehmern und Mitgliedern des Studienteams ein. Schließlich wurde das Material direkt im Labor der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Mannheim gesammelt und von den Hebammen des Krankenhauses geliefert. Das Komitee gab die folgenden Anweisungen, die strikt eingehalten wurden: (1) Das Projekt ist eine Machbarkeitsstudie/Methodenstudie, bei der Restmaterial zur Etablierung einer Labormethode verwendet wird, und (2) da keine genetischen Studien geplant waren, konnte das Biomaterial verwendet werden höchstens als pseudonym gelten. Nach Abschluss wurde das Biomaterial zerstört.

Die im Rahmen der Studie generierten und analysierten Datensätze sind aufgrund des geltenden Datenschutzrechts des Landes Baden-Württemberg nicht öffentlich zugänglich, können jedoch auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor eingesehen werden.

Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor

Varianzanalyse

Koeffizientenvariation

Dynamische Mehrfachreaktionsüberwachung

Elektrospray-Ionisation

G-Protein-gekoppelter Rezeptor 35

G-Protein-gekoppelter Rezeptor 127

G-Protein-gekoppelter Rezeptor 142

Indolamin-2,3-Dioxygenase

Kynurenin-Aminotransferase

Kynurenin-Weg

Kynurenin

Kynurensäure

Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Unterste Bestimmungsgrenze

Mittlerer Unterschied

Nicotinamidadenindinukleotid

N-Methyl-D-aspartat

Tryptophan-2,3-Dioxygenase

Tryptophan

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Die Autoren dieser Studie danken der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Mannheim (Direktor: Prof. Dr. Sütterlin); Besonderer Dank geht an Dr. Christiane Otto, die uns bei der Zugänglichkeit der Plazentaproben geholfen hat. Diese Forschung wurde teilweise vom polnischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft im Rahmen der gesetzlichen Tätigkeit der Medizinischen Universität Lublin unterstützt (Projekt Nr. DS 670/2023 an EF vergeben).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei und teilten sich die Erstautorenschaft: Bruno Pedraz-Petrozzi und Marta Marszalek-Grabska.

Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie, Zentralinstitut für Seelische Gesundheit, Medizinische Fakultät Mannheim, Universität Heidelberg, J5, 68159, Mannheim, Deutschland

Bruno Pedraz-Petrozzi, Eva Kathryn Lamade, Maria Gilles & Michael Deuschle

Abteilung für experimentelle und klinische Pharmakologie, Medizinische Universität Lublin, Jaczewskiego 8b, 20-090, Lublin, Polen

Marta Marszalek-Grabska & Waldemar A. Turski

Abteilung für Bioanalytik, Medizinische Universität Lublin, Jaczewskiego 8b, 20-090, Lublin, Polen

Anna Kozub, Klaudia Szalaj, Alicja Trzpil, Anna Stachniuk und Emilia Fornal

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BP-P.: Idee, Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung. MM-G.: Idee, Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung. AK: Probenvorbereitung, LC/MS-Analysen. KS: Probenvorbereitung. AT: LC/MS-Analysen, Datenverarbeitung. AS: Datenverarbeitung. EKL: Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. MG: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. MD: Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision, Projektverwaltung. WAT: Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision. EF: LC/MS-Methodik, Betreuung, Finanzierung, Datenverarbeitung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. BP-P. und MM-G teilten sich die Erstautorenschaft dieses Artikels.

Korrespondenz mit Bruno Pedraz-Petrozzi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Pedraz-Petrozzi, B., Marszalek-Grabska, M., Kozub, A. et al. LC-MS/MS-basierte Quantifizierung von Tryptophan, Kynurenin und Kynurensäure in menschlichen Plazenta-, Fötusmembran- und Nabelschnurproben. Sci Rep 13, 12554 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39774-3

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Eingegangen: 27. März 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39774-3

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