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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11399 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Vier Bakterienisolate wurden aus Meeressedimenten gewonnen, die in Sahl Hashish, Hurghada, Rotes Meer, Ägypten, gesammelt wurden. Ziel dieser Studie war es, nach vielversprechenden natürlichen Polysacchariden gegen Alzheimer zu suchen. Daher wurden vier Isolate auf die Produktion von Exopolysacchariden (EPS) und die Hemmung der Acetylcholinesterase untersucht. Das Isolat S16 lieferte die höchste EPS-Ausbeute (7,51 g/L) und Acetylcholinesterase-Hemmung. Es wurde morphologisch und genetisch mithilfe einer 16S-rRNA-Gensequenzanalyse als Bacillus maritimus identifiziert. Eine physikalisch-chemische Analyse des S16-Exopolysaccharids (BMEPS) ergab Schätzungen, die auf das Vorhandensein von Uronsäure und Sulfat (24,7 % bzw. 18,3 %) hinwiesen. Die HPLC-Analyse ergab, dass Mannuronsäure, Glucuronsäure, Glucose und Mannose in einem Molverhältnis von 0,8:1,0:2,8:2,3 vorliegen. Darüber hinaus zeigte FT-IR eine Fülle von β-Konfigurationen. Das GPC schätzte das durchschnittliche Molekulargewicht (Mw) auf 4,31 × 104 g/mol. BMEPS inhibierte AChE (IC50; 691,77 ± 8,65 μg/ml), BChE (IC50; 288,27 ± 10,50 μg/ml) und Tyrosinase (IC50; 3,34 ± 0,09, 14,00 ± 0,14 und 22,96 ± 1,23 μg/ml während der Inkubationsdauer von 10, 20 und 40 Minuten). Es zeigte auch eine selektive entzündungshemmende Wirkung gegen COX-2 statt gegen COX-1. Darüber hinaus zeigte BMEPS antioxidative Eigenschaften als Fänger freier Radikale und sauerstoffreaktiver Spezies (ROS), als Metallchelatbildner, als Reduktionsmittel und als Unterdrücker der Lipidperoxidation. Diese Aktivitäten sind auf die unterschiedliche chemische Zusammensetzung zurückzuführen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass BMEPS in einem In-vitro-Modell als vielversprechendes Material gegen die Alzheimer-Krankheit (AD) angesehen werden könnte, was es für fortgeschrittene In-vivo-Studien zur Entdeckung alternativer Alzheimer-Behandlungen qualifiziert.

Die weltweit am häufigsten vorkommende organische Substanz ist Polysaccharid1. Polysaccharide sind häufig vorkommende biologische Makromoleküle, die an einer Vielzahl physiologischer Funktionen des Menschen beteiligt sind. Es erfüllt eine Vielzahl biologischer Funktionen, darunter die Steuerung der immunologischen Funktion, des Blutdrucks, des Blutzuckers und der Blutzirkulation1. Industrielle Polysaccharide stammen häufig aus Pflanzen, Tieren, Algen und Mikroben. Mikroorganismen sezernieren lösliche oder unlösliche Polymere, sogenannte EPSs2. Darüber hinaus gelten Mikroorganismen unter allen Polysaccharidlieferanten als hoch reproduzierbare Strukturen und unterliegen strengen Regulierungen, während Exopolysaccharidstrukturen (EPS), die aus pflanzlichen und tierischen Quellen hergestellt werden, durch Klima-, Umwelt- und Futterbedingungen beeinflusst werden. Meeresumwelten stellen vor allem einen großen und besonderen Lebensraum dar, in dem verschiedene Bakterienpopulationen für wesentliche Funktionen für das Überleben der Ökologie des Planeten erforderlich sind. Andererseits werden EPS aufgrund ihrer besonderen physikalischen und rheologischen Eigenschaften häufig als Viskositäts-, Stabilisierungs-, Gelier- oder Emulgiermittel in der Lebensmittelindustrie eingesetzt2. Mikrobielle Polysaccharide werden in neue Ziele eingebaut, wie z. B. Bioflockungsmittel, Bioabsorptionsmittel, Mittel zur Schwermetallentfernung und Wirkstoffabgabemittel3. Darüber hinaus gehören antitumorale, antivirale, immunstimulierende und entzündungshemmende Wirkungen zu den biologischen Wirkungen von EPS4. Unter den Mikroorganismen befindet sich Bacillus sap. Stämme produzieren viele Arten von EPS wie Levan, β-(1,3)-Glucan5, saures EPS aus marinem B. amyloliquefaciens 3MS 20176 und saures EPS aus Bacillus sp. NRC57. Einige Bacillus EPSs zeigten außergewöhnliche Emulgier-, Flockungs-, Schwermetallentfernungs- oder medizinische Eigenschaften5.

AD ist eine chronische neurodegenerative Erkrankung8. Derzeit wird bei etwa ≃ 50 Millionen Menschen AD diagnostiziert, und bis 2050 wird diese Zahl voraussichtlich 130 Millionen überschreiten9. Die mit mehreren wichtigen physiologischen Vorgängen verbundenen Anomalien sind für die mehrdimensionale Toxizität verantwortlich, zu der auch cholinerge Toxizität, Amyloidbelastung, Metallionentoxizität, Tau-Toxizität, biomolekulare Schäden, oxidativer Stress, Immunschädigung, neurovaskuläre Toxizität, Calciumionen-Dyshomöostase und lymphatische Dysfunktion gehören , mitochondriale Dysfunktionen, α-Synuclein-vermittelte Toxizität, synaptische Fehlfunktionen, Membrantoxizität, Apoptose-Fehlfunktionen, Verschlechterung der Telomerase-Aktivität, aberrante posttranslationale Modifikationen, mikrobielles Ungleichgewicht und Infektion, Hyperglykämie, Stress des endoplasmatischen Retikulums, Hypercholesterinämie, Autophagie-Fehlfunktionen, genetisches Risiko und Insulinresistenz sowie Diabetes10. Im ZNS (Zentralnervensystem) spielen Metallionen (CuII, ZnII und FeIII) unter normalen Bedingungen die Rolle von Cofaktoren für Enzyme und erfüllen mitochondriale und neuronale Funktionen11. Im Gegenteil koordinieren ZnII, CuII und FeII mit Aβ und beschleunigen die Amyloidakkumulation und die Bildung metallabhängiger Plaques. Aβ-Cu- und Aβ-Fe-Komplexe induzieren die Produktion überschüssiger reaktiver Zwischenspezies (RIS). RIS sind entscheidende Komponenten für die Auslösung von oxidativem Stress und Neuroentzündungen8. Daher ist die Entdeckung von Metallchelatbildnern ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die Überproduktion von RIS (Superoxidradikal, Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikal, Stickoxid, Peroxynitrit und hypochlorige Säure) fördert kritischen oxidativen Stress, der Lipide und Proteine ​​schädigt und zum Absterben von Neuronen führt. AD-Gehirngewebe leiden erheblich unter übermäßigen RIS-Werten8. Die redoxaktiven Metallionen (CuII und FeIII) fangen das Aβ-Peptid ein, stabilisieren oligomere Spezies und fungieren als Depot für die Produktion von überschüssigem RIS12. Daher ist oxidativer Stress die Grundlage für das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit und ein potenzieller Angriffspunkt bei AD-Behandlungen10. Die neuronale Plasmamembran enthält eine große Menge mehrfach ungesättigter Fettsäuren, die anfällig für Peroxidation durch RIS sind, was neurotoxische Komponenten wie 4-Hydroxynonenal induziert13. Im AD-Hirngewebe hemmen durch oxidativen Stress vermittelte Cholesterin-Mikrodomänen das Antioxidans Vitamin E in der Lipidmembran. Basierend auf der vorherigen Erklärung ist oxidativer Stress der Schlüsselfaktor bei zellulären Funktionsstörungen, die mit AD zusammenhängen. Parallel dazu wurde nachgewiesen, dass viele aus Organismen gewonnene Polysaccharide über antioxidative Eigenschaften verfügen, darunter i) das Einfangen von Metallionen (CuII, ZnII und FeIII); ii) Hemmung der ROS- und RNS-Produktion; iii) Schutz der Lipide vor Peroxidation; und iv) Neutralisierung freier Radikale. Beispielsweise EPS von Adansonia digitata14, EPS von Novel Bacillus sp. M315, EPS von Paenibacillus lactes NRC116, EPS von B. amyloliquefaciens 3MS 20176 und EPS von Bacillus sp. NRC57. Andererseits spielen cholinerge Neuronen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl kognitiver Prozesse, einschließlich Gedächtnis, Aufmerksamkeit, Reaktion und der Verarbeitung sensorischer Informationen. Die Beeinträchtigung cholinerger Neuronen ist mit cholinerger Toxizität verbunden. Daher bleibt die Verbesserung der cholinergen Neurotransmission der Hauptansatz bei der symptomatischen Behandlung kognitiver und Verhaltensstörungen in den frühen Stadien von AD10. Wenn Acetylcholinesterase (AChE) im synaptischen Spalt vorhanden ist, hydrolysiert Acetylcholin zu Cholin und Essigsäure. Cholinacetyltransferase (ChAT) und AChE-Enzyme steuern die ACh-Synthese und den ACh-Abbau10. Der Defekt der ChAT-Aktivität oder die Hyperaktivität von AChE bei AD-Patienten führt zu einer vermuteten Verringerung des ACh-Gehalts am synaptischen Spalt im Kortex, Hippocampus und Amygdala. Daher ist die Reparatur cholinerger neuronaler Fehlbildungen ein Ziel zur Verbesserung kognitiver Störungen bei AD-Patienten. Dementsprechend verhindern AChE-Inhibitoren die ACh-Hydrolyse im Gehirn, was die Konzentrationen von ACh im Gehirn erhöht und den Mangel an cholinerger Neurotransmission im Gehirn verbessert. Viele Polysaccharide von Organismen haben eine AChE-hemmende Wirkung, wie etwa EPS von Achromobacter piechaudii NRC217, EPS von Isochrysis galbana und Nannochloropsis oculate18 sowie Polysaccharide von Pilzen19.

Andererseits ist die Tyrosinase-Katalyse die Umwandlung der Aminosäure L-Tyrosin in die Verbindung L-3,4-Dihydroxyphenylamin (L-DOPA). Die entscheidenden Neurotransmitter Noradrenalin und Adrenalin sind Vorläufer der wichtigsten Neurotransmitter L-DOPA bzw. Dopamin. Tyrosinase wird durch 14-3-3-Proteine ​​durch phosphorylierungsabhängige Bindung aktiviert. Tyrosinase und neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit stehen aufgrund der 14-3-3-Proteine ​​in indirektem Zusammenhang. Außerdem kann Tyrosinase Neuronen schädigen, indem sie Dopaminchinone produziert, die den Catecholring von Dopamin oxidieren können, um die äußerst reaktive Verbindung Dopaminchinon zu produzieren. Die Oxidation von Dopamin hemmt die Fortbewegung von Dopamin, Glutamat und die Mitochondrienatmung20. Tyrosinasehemmer sind Medikamente, die die Tyrosinaseaktivität unterdrücken können. Mehrere Polysaccharide natürlichen Ursprungs zeigten Anti-Tyrosinase-Aktivität, wie z. B. die Perikarp-Polysaccharide der Frucht, Longan21 und Usnea longissima-Polysaccharide22.

Ziel der aktuellen Studie war die Suche nach einem neuen bioaktiven Exo-Polysaccharid (EPS) aus Meeresquellen, begleitet von dessen Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung, gefolgt von einer In-vitro-Route-Untersuchung dieses Polysaccharids zur Behandlung von Alzheimer-Risikofaktoren: oxidativer Stress, Fortschreiten der Entzündung, Abbau von Neurotransmittern und Akkumulation von Amyloid-β.

Vier Isolate von Meeresbakterien, S4, S7, S13 und S16, wurden ausgewertet und es wurde festgestellt, dass sie eine relativ hohe Ausbeute an EPSs von 6,99, 8,66, 7,22 bzw. 7,51 g/L aufwiesen (Tabelle 1). Die EPSs von vier Isolaten wurden auf ihre Acetylcholinesterase-Aktivität untersucht. In einem primären Screening-Test erwiesen sich EPS (S4 und S16) als die höchsten Isolate als Acetylcholinesterase-Inhibitoren (42,0 bzw. 52,2 %) in einer Konzentration von 1000 µg/ml (Tabelle 1). Die EPSs von vier Isolaten wurden auf ihre Acetylcholinesterase-Aktivität untersucht. In einem primären Screening-Test erwiesen sich EPS (S4 und S16) in einer Konzentration von 1000 µg/ml als das höchste Isolat als Acetylcholinesterase-Inhibitor (42,0 bzw. 52,2 %) (Tabelle 1).

Die meisten Bakterienisolate mit hoher Acetylcholinesterase-Hemmaktivität (S16) wurden morphologischen, physiologischen und biochemischen Eigenschaften unterzogen. Die Kolonie- und morphologischen Eigenschaften von isoliertem S16 wurden drei Tage lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt vom Ausstreichen der Reinkulturen auf Platten. Darüber hinaus bildete der Stamm glitzernde, schleimige, schleimige Kolonien auf Agarplatten und war in der Lage, bei Expansion mit einer Impföse lange Stränge zu produzieren, die die typischen Eigenschaften von EPS-produzierenden Phänotypen aufwiesen. S16 wurde anhand morphologischer und kultureller Merkmale sowie physiologischer und biochemischer Studien identifiziert. Basierend auf den S16-rRNA-Sequenzen des Stammes S16 wurde ein phylogenetischer Baum erstellt. Das Bakterienisolat (S16) wurde hauptsächlich als grampositiv, endosporenbildend, glatte Textur, Stäbchenform (Abb. 1A), Katalase-positiv, Stärkehydrolyse-positiv und Voges-Proskauer (VP)-Test, Citrat-Test negativ identifiziert. Die phylogenetische Analyse der 16S-rRNA zeigte, dass das vielversprechende Bakterienisolat (S16) zur Gamma-Unterteilung des Proteobacteria-Stamms gehörte und eng mit Bacillus maritimus MSM1 mit der Zugangsnummer MK829155 verwandt ist (Abb. 1B).

Koloniemorphologie von Bacillus maritimus MSM1 auf festem Meeresmedium (A) und benachbarter phylogenetischer Stammbaum basierend auf 16S-rRNA-Gensequenzen (B).

Der hohe EPS-Gehalt betrug 7,51 g/L bei einer dreitägigen Fermentation bei 37 °C, bestimmt durch den Phenol-H2SO4-Assay unter Verwendung von Glucose als Standard. Aus der fermentierten Brühe wurde durch Ethanolfällung und Dehydratisierung mit Aceton und Diethylether rohes EPS gewonnen. Nach der Zentrifugation und der oben erwähnten Dekantierung mit Ethanol wurde das Roh-EPS einem weiteren Fällungsschritt mit kaltem 100 %igem Ethanol unterzogen. Das resultierende Pellet wurde dann erneut vorsichtig in einem Wasserbad auf 50 °C erhitzt, um eine vollständige Auflösung zu erreichen. Das Pellet wurde dann in einer minimalen Menge entionisiertem Wasser erneut aufgelöst. Danach wurde das Pellet in einer kleinen Menge entionisiertem Wasser erneut aufgelöst, und für die vollständige Auflösung des Pellets war noch einmal leichtes Erhitzen in einem Wasserbad auf 50 °C erforderlich. Die dialysierte Lösung wurde mit 1, 2 und 3 l kaltem absolutem Ethanol fraktioniert ausgefällt, nachdem der pH-Wert der klaren Lösung eingestellt und dreimal dialysiert worden war. Die aus 1 Volumen absolutem Ethanol erhaltene Hauptausbeutefraktion wurde unter Vakuum bei 40 °C getrocknet, um BMEPS zu erhalten, das für die folgende Analyse verwendet wurde. Es zeigte nur einen Peak bei 210 nm im UV-Spektrum von BMEPS, und es gab keine Peaks zwischen 260 und 290 nm, was zeigte, dass in BMEPS keine Proteine ​​oder Nukleinsäuren beobachtet wurden. Laut einer Untersuchung der UV-Vis-Spektroskopie lag die höchste Absorption aufgrund von n- und/oder-*-Übergängen, die typisch für funktionelle Amingruppen sind, zwischen 200 und 220 nm. Darüber hinaus enthielt BMEPS laut kolorimetrischer m-Hydroxydiphenyl-Analyse 18,3 % Sulfat und 24,7 % Uronsäure. Das FT-IR-Spektrum (Abb. 2A) zeigte eine starke Bande bei 3412,52 cm−1, die der O-H-Streckschwingung von BMEPS zugeschrieben wird. Die 2927,24 cm-1-Bande wurde durch C-H-Streckschwingungen verursacht. Ein symmetrisch verlängerter Peak nahe 1386,72 cm−1 zeigte die Existenz von COO−-Gruppen. Die markante Absorption bei 1641,52 cm−1 wurde C = O-Schwingungen zugeschrieben. Darüber hinaus deuten markante Absorptionen bei 915,22 cm−1 auf das gleichzeitige Vorhandensein von β-Konfigurationen in BMEPS hin. Es wurden eine HPLC-Analyse der chemischen Struktur von BMEPS und ein Vergleich mit Monosaccharidstandards durchgeführt. BMEPS bestand aus Mannuronsäure, Glukuronsäure, Glucose und Mannose in einem Molverhältnis von 0,8:1,0:2,8:2,3 (Abb. S1, ergänzende Daten). Die GPC-Analyse (Abb. 2B) schätzte das durchschnittliche Molekulargewicht (Mw) des BMEPS auf 4,31 × 104 g/mol und die durchschnittliche Molekularzahl (Mn) auf 3,87 × 104 g/mol. Die Disparität, die als Verhältnis von Mw zu Mn definiert ist, betrug 1,1.

Das FTIR-Spektrum von BMEPS aus Bacillus maritimus MSM1 (A) und Molekulargewicht (B).

Antioxidative Verbindungen sind Reduktionsmittel oder Oxidationsinhibitoren. Antioxidative Substanzen als Reduktionsmittel können die oxidierte Fe3+-Form in das reduzierte Fe2+-Ion in der Ferricyanidverbindung reduzieren. Dabei wandelt sich die gelbe Farbe von Fe3+ in zahlreiche Grüntöne um und es entsteht blaues Fe2+ aufgrund der reduzierenden Wirkung antioxidativer Proben. BMEPS zeigte im Vergleich zu Referenzmaterialien einen schwachen Fe3+-reduktiven Effekt (Abb. 3A). Es zeigte eine Reduktionskraft, dargestellt als Absorption, die bei 0,200 ± 0,02 bei 100 μg/ml begann und bei 0,444 ± 0,03 bei 1000 μg/ml endete, im Vergleich zu Ascorbinsäure (0,392 ± 0,004 bis 0,780 ± 0,003) oder BHT (0,287 ± 0,013 bis). 0,603 ± 0,03) bei gleichen Konzentrationen. IC50 von Fe3+ war größer als Ascorbinsäure oder BHT; 1263,26, 237,13 bzw. 518,05 μg/ml.

Reduktionsfähigkeit (A), Metallchelatbildung (B) und Lipidperoxidationsunterdrückung (C) von BMEPS bei unterschiedlichen Konzentrationen (100–1000 μg/ml) im Vergleich zu den Referenzmaterialien LAA und BHT. (LAA: L-Ascorbinsäure und BHT: Butylhydroxytoluol). Die Daten wurden als Mittelwert ± SE dargestellt. Für die Datenanalyse wurde eine einfache ANOVA verwendet (n = 3, P ≤ 0,05). Den Daten folgen Kleinbuchstaben; a bedeutet signifikanten Unterschied zu Ascorbinsäure, b bedeutet signifikanten Unterschied zu BHT.

Ferrozin kann mit Fe2+-Ionen im Medium reagieren und Komplexe bilden. Chelatormaterialien konkurrieren mit Fe2+ um die Reaktion mit Ferrozin, wenn sie im Reaktionsmedium vorhanden sind. Dadurch verschwand die rote Farbe des Ferrozin-Fe2+-Komplexes, was darauf hinweist, dass die Komplexbildung verhindert wurde, da das untersuchte Chelatormaterial Fe2+ vor Ferrozin einfing. Die Veränderungen in der Farbintensität weisen auf die gleichzeitig vorhandenen Chelatoren hin23.

BMEPS zeigte im Vergleich zu Referenzmaterialien eine mäßige Fe+2-Chelatbildungskapazität (Abb. 3B). Es verhinderte die Bildung von Ferrozin-Fe+2-Komplexen (29,2 % 0 ± 1,51 bis 54,04 % ± 2,96 bei 100 bis 1000 μg/ml) im Vergleich zu LAA (62,99 % ± 1,01 bis 98,19 % ± 1,82) oder BHT (52,41 % ± 1,59 bis). 99,09 % ± 0,90) bei gleichen Konzentrationen. Daraus konnte geschlossen werden, dass der IC50-Wert von BMEPS (827,46 μg/ml) höher war als die IC50-Werte von LAA oder BHT; 26,36 bzw. 68,88 μg/ml.

Lipidperoxidation ist eine Reihe von Kettenreaktionen, an denen freie Radikale beteiligt sind und die verschiedene gesundheitliche Schäden verursachen können. Die ungesättigten Fettsäuren werden durch ROS angegriffen und lösen radikalische Peroxidationskettenreaktionen aus. Wenn Linolsäure mit einem Initiator (Fe2−/H2O2) inkubiert wird, wird sie oxidiert und bildet Hydroperoxide. Im Thiocyanatsystem werden Eisenionen durch Linoleatradikale oxidiert, um Eisenionen zu erzeugen, die dann spektrophotometrisch gemessen werden. Die antioxidativen Komponenten hemmten die Oxidation von Eisenionen und verhinderten so die Bildung von Linolradikalen im System24.

Was die Referenzmaterialien betrifft, so zeigte BMEPS eine starke Fähigkeit zur Hemmung der Lipidperoxidation. BMEPS blockierte 32,42 % ± 1,46 der Linolsäureoxidation im Reaktionsmedium bei der niedrigsten Konzentration (100 μg/ml) im Vergleich zu LAA (64,73 % ± 2,20) oder BHT (60,31 % ± 1,69) bei derselben Konzentration. Eine Erhöhung der BMEPS-Konzentration auf 1000 µg/ml erhöhte die Hemmung der Linolsäureoxidation auf 60,22 % ± 1,78, verglichen mit LAA (100 % ± 0,0) oder BHT (100 % ± 0,0) bei denselben Konzentrationen (Abb. 3C). Die 552,50 µg/ml ist eine BMEPS-Konzentration, die die Oxidation von 50 % der Linolsäuremoleküle hemmen kann, während LAA- oder BHT-Referenzmaterialien 28,64 bzw. 39,30 µg/ml ausmachten.

Der DPPH•-Scavenging-Assay wurde erstmals in den 1950er Jahren vorgeschlagen, um ursprünglich H-Donoren in natürlichen Materialien zu entdecken. Das DPPH•-Radikal, ein Chromogen mit violetter Farbe, ist ein stabiles freies Radikal. Der DPPH•-Assay war abhängig von der DPPH•-Reduktion in Alkohol durch ein wasserstoffspendendes Antioxidans und bildete die nichtradikale DPPH-H-Form, das gelb gefärbte Diphenylpikrihydrazin. BMEPS zeigte im Vergleich zu Referenzmaterialien eine starke DPPH•-Fängerwirkung. Bei der niedrigsten BMEPS-Konzentration wurde DPPH• stark abgefangen (81,67 % ± 1,70), verglichen mit LAA (75,17 % ± 1,30) oder BHT (80,46 % ± 2,52) bei den gleichen Konzentrationen (Abb. 4A). Eine Erhöhung der BMEPS-Konzentration auf 1000 μg/ml erhöhte den DPPH•-Abfangprozentsatz geringfügig auf 85,37 % ± 2,63 im Vergleich zu LAA (100,00 % ± 0,00) oder BHT (98,32 % ± 1,69).

Spülkapazität von BMEPS; DPPH• (A) und ABTS + (B), Superoxid (C) und NO (D) in unterschiedlichen Konzentrationen (100–1000 μg/ml) im Vergleich zu Referenzmaterialien; LAA und BHT. (NO: Stickoxidradikal; LAA: L-Ascorbinsäure; BHT: Butylhydroxytoluol; DPPH.: freies 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradikal). Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt. Für die Datenanalyse wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet (n = 3, P < 0,05). Den Daten folgen Kleinbuchstaben; a bedeutet signifikanten Unterschied zu Ascorbinsäure, b bedeutet signifikanten Unterschied zu BHT.

Im Entfärbungstest wurde die Radikalfängerwirksamkeit von BMEPS mithilfe des kationischen Radikals ABTS•+ abgeschätzt. Diese Wirksamkeit wurde im Vergleich mit zwei Referenzmaterialien bewertet; LAA und BHT. Das ABTS•+-Kationradikal wird direkt vor der Reaktion mit wasserstoffspendenden Antioxidantien freigesetzt und erzeugt einen blau/grünen ABTS•+-Chromophor. ABTS•+ kann entweder durch direkte Reduktion über Elektronenübertragungen oder durch Radikallöschung über Wasserstoffatomübertragung25 neutralisiert werden.

BMEPS zeigte eine starke konzentrationsabhängige Fähigkeit zum Abfangen von ABTS+-Kationen (Abb. 4B). Die niedrigste Konzentration (100 μg/ml) von BMEPS fing einen niedrigen ABTS+-Fängerprozentsatz (20,32 % ± 0,68) im Vergleich zu LAA (66,32 % ± 2,68) oder BHT (62,18 % ± 1,81) ab. Dementsprechend wurden bei einer Erhöhung der Konzentration auf 1000 µg/ml mehr Mengen an ABTS+-Kationenradikalen abgefangen (99,52 % ± 0,51) als bei LAA (100,00 % ± 0,00) oder BHT (100,00 % ± 0,00). Zwischen BMEPS, LAA und BHT wurden bei 750 und 1000 µg/ml unbedeutende Unterschiede festgestellt. Der IC50-Wert der BMEPs betrug 333,22 μg/ml, wohingegen LAA oder BHT 18,61 bzw. 33,44 μg/ml aufwiesen.

Superoxid (O2), anionisches Sauerstoffgas (O2), ist eine Hauptursache für oxidativen Stress. O2·−wird in Phenazinmethosulfat (PMS)-Nicotinamidadenindinukleotid (NADH)-Systemen durch Oxidation von NADH erzeugt und durch Reduktion von Nitroblautetrazolium (NBT) bestimmt. Bei dieser Methode reduziert O2 den gelben Farbstoff NBT2+ zum blauen Formazan, das spektrophotometrisch bei 560 nm gemessen wird. Im Allgemeinen können Antioxidantien die Bildung von blauem NBT hemmen. Die Abnahme der Absorption zeigt den Verbrauch von Superoxidanionen in der Reaktionsmischung an, was das Vorhandensein von antioxidativem Material bedeutet.

BMEPS erfasste O2-Radikale in konzentrationsabhängiger Weise im Vergleich zu Referenzmaterialien (Abb. 4C). In Reaktionsmedien, die BMEPS in aufeinanderfolgenden Konzentrationen (100–1000 µg/ml) enthielten, wurden 68,45 % ± 1,55 bis 99,33 % ± 0,67 der O2-Radikale eingefangen, verglichen mit LAA (66,21 % ± 1,79 bis 98,11 % ± 2,25) und BHT (73,22). ± 2,78 bis 98,11 % ± 1,89) bei gleichen Konzentrationen. Die höchste Konzentration an BMEPS, LAA und BHT zeigte, dass die O2-Fängerfähigkeit nahezu gleich war. Die BMEPS-Konzentration zur Hemmung von 50 % der erzeugten O2-Radikale betrug 19,96 µg/ml im Vergleich zu LAA und BHT; 22,35 bzw. 20,551 µg/ml.

Aus SNP freigesetztes Stickstoffmonoxid (NO) hat ein starkes NO+, das die Struktur und Funktionalität zahlreicher Zellkomponenten verändern kann. Wenn NO mit Superoxid interagiert, um das Peroxynitrit-Anion (. ONOO-) zu erzeugen, steigt seine Toxizität, da es sich um ein potenziell starkes Oxidationsmittel handelt, das unter Bildung von OH und NO226 zerfallen kann.

BMEPS übte eine schwache Wirkung auf NO aus; Die Abfangprozentsätze betrugen 18,62 % ± 0,61 bis 38,32 % ± 1,19 bei Konzentrationen von 100 bis 1000 μg/ml mit entsprechendem LAA (64,39 % ± 1,61 bis 93,27 % ± 2,73) oder BHT (65,99 % ± 2,00 und 95,88 % ± 1,89). Der IC50-Wert von BMEPS betrug 2403,253 µg/ml im Vergleich zu LAA und BHT (19,96 und 16,93 µg/ml, Abb. 4D).

Die entzündungshemmende BMEPS-Aktivität wurde durch Berechnung des Hemmungsprozentsatzes von H2O2 gemessen, das bei der Oxidation von Leukodichlorfluorescein (1-DCF) in Gegenwart von Phenol freigesetzt wird. Die entzündungshemmende Wirksamkeit von Polysacchariden wurde im Vergleich zu Celecoxib als entzündungshemmendem Arzneimittel mit höherer Selektivität gegenüber COX-2 als gegenüber COX-1 untersucht. Die repressive Wirkung von BMEPs auf COX-1 war geringer als ihre Wirkung auf COX-2 (Abb. 5A). COX-1 verzeichnete eine leichte Hemmung (6,21 % ± 0,09 bis 20,82 % ± 1,00 mit BMEPs (100–1000 μg/ml) im Vergleich zur Hemmung mit Celecoxib; 2,36 % ± 0,77 und 17,24 % ± 1,51 bei den gleichen Konzentrationen. Der IC50 von BMEPS (6367,38 μg/ml) war höher als der von Celecoxib (3820,64 μg/ml), was bedeutet, dass dieses Polysaccharid im physiologischen System sicherer ist als Celecoxib.

COX-1- (A) und COX-2-Hemmungsaktivität (B) verschiedener Konzentrationen (100–1000 μg/ml) von BMEPS und Celecoxib. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt. Für die Datenanalyse wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet (n = 3, p < 0,05). Auf die Daten folgt ein Kleinbuchstabe, was auf einen signifikanten Unterschied zu Celecoxib hinweist.

BMEPS unterdrückte die COX-2-Aktivität um etwa 20,74 % ± 1,00, 30,34 % ± 1,52, 49,67 % ± 1,63, 62,88 % ± 1,85 und 78,09 % ± 2,00 bei 100, 250, 500, 750 und 1000 μg/ml. im Vergleich zu Celecoxib (Abb. 5B). Dementsprechend kann BMEPS in einer Konzentration von 500,40 μg/ml COX-2 um 50 % hemmen, verglichen mit Celecoxib, das 221,72 μg/ml ausmachte.

BMEPS hatte eine mäßige AChE-hemmende Wirkung, wobei die Konzentration abhängig war. BMEPS zeigte AChE-Hemmungsprozentsätze im Bereich von 24,82 % ± 0,88 bis 60,15 % ± 1,85 bei Konzentrationen von 100 bis 1000 ug/ml (Abb. 6A). 691,77 μg/ml ist die Konzentration an BMEPs, die 50 % der AChE-Aktivität blockierte. BMEPS zeigte eine BChE-Inhibitionsaktivität zwischen 39,78 % ± 1,73 und 94,62 % ± 2,66 bei Konzentrationen zwischen 100 und 1000 µg/ml (Abb. 6B). Folglich ist 288,27 µg/ml die Konzentration, die 50 % eines Enzyms hemmt (IC50 von BMEPS).

Cholinesterase-hemmende Wirkung von BMEPS in verschiedenen Konzentrationen (100–1000/ml), AChE (A) und BChE (B). Die Daten wurden als Mittelwert ± SE dargestellt. Für die Datenanalyse wurde eine einfache ANOVA verwendet (n = 3, P ≤ 0,05).

Tyrosinase ist eine Oxidoreduktase, die Kupfer enthält. Es beschleunigt den Prozess der ortho-Hydroxylierung von Monophenolen und der aeroben Oxidation von Catechol. Die Aktivität des Enzyms wurde durch spektrophotometrische Messung der Oxidation von 3,4-Dihydroxyphenylalanin (L. DOPA) zum roten Dopachrom gemessen. Die Anti-Tyrosinase-Aktivität von BMEPs wurde während drei Inkubationsperioden (10, 20 und 40 Minuten) bestimmt und mit Kojisäure als Standardinhibitor verglichen. BMEPS zeigte im Vergleich zu Kojisäure eine starke Anti-Tyrosinase-Wirkung in Bezug auf Konzentration und zeitabhängige Wirkung (Abb. 7). Die Anti-Tyrosinase-Wirkung von BMEPS wurde durch eine Verlängerung der Inkubationszeit verstärkt. Der durch BMEPS aufgezeichnete Prozentsatz der Tyrosinasehemmung lag zwischen 5,18 % ± 0,18 und 23,55 % ± 0,56 bei Konzentrationen von 100 bis 1000 μg/ml nach 10-minütiger Inkubation, verglichen mit Kojisäure von 9,34 % ± 0,66 bis 40,35 % ± 1,65 bei den gleichen Konzentrationen. Die Wirksamkeit der Hemmung wurde erhöht, indem die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Hemmung nach 40-minütiger Inkubation verlängert wurde; 29,64 % ± 0,68 bis 58,78 % ± 1,85 bei Konzentrationen von 100 bis 1000 μg/ml, verglichen mit Kojisäure (70,32 % ± 1,68 bis 100 % ± 0,0) bei gleichen Konzentrationen. Die IC50-Werte von BMEPS waren in allen Inkubationsperioden (3,34, 14,00 und 22,96 μg/ml nach 10, 20 und 40 Minuten) niedriger als die von Kojisäure (6,00, 29,62 und 62,97 μg/ml) bei derselben Dauer, was bedeutet, dass Das getestete Polysaccharid ist als Anti-Tyrosinase-Inhibitor vielversprechender als Kojisäure.

Tyrosinase-Hemmungsaktivität verschiedener Konzentrationen (100–1000 μg/ml) von BMEPS und Referenzmaterialien Kojisäure. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt. Für die Datenanalyse wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet (n = 3, P < 0,05). Den Daten folgen Kleinbuchstaben; Dies bedeutet einen signifikanten Unterschied zu Kojisäure.

Meeresbakterien verschiedener Gattungen sind eine vielversprechende Quelle für die Produktion mehrerer bioaktiver Substanzen mit vielfältigen biotechnologischen Einsatzmöglichkeiten. Viele als EPS bekannte Bakterienverbindungen haben ein breites Anwendungsspektrum und herausragende physiologische Aktivitäten wie Kristallisation, Emulgierung und Antioxidantien27. Vier Isolate der Meeresbakterien S4, S7, S13 und S16 wurden auf die EPS-Produktion untersucht und es wurde festgestellt, dass das Isolat S16 die relativ höchste EPS-Ausbeute und Acetylcholinesterase-Inhibitor-Wirksamkeit aufweist. Das vielversprechende Bakterienisolat (S16) gehört zur Gamma-Unterabteilung des Proteobacteria-Stamms und ist eng mit Bacillus maritimus MSM1 verwandt.

Die chemische Zusammensetzung von BMEPS wurde bewertet. Die Monosacchariduntersuchung wurde mittels HPLC durchgeführt und mit Standards verglichen. BMEPS bestand aus Mannuronsäure, Glukuronsäure, Glucose und Mannose in einem Molverhältnis von 0,8:1,0:2,8:2,3. Die GPC-Analyse schätzte das durchschnittliche Molekulargewicht (Mw) des BMEPS auf 4,31 × 104 g/mol und die durchschnittliche Molekularzahl (Mn) auf 3,87 × 104 g/mol. Die Disparität, die als Verhältnis von Mw zu Mn definiert ist, betrug 1,1. Pentosen, Hexosen oder Uronsäuren sind typischerweise in sich wiederholenden Einheiten strukturiert und machen den Großteil der von Meeresbakterien produzierten EPS aus. Da die Lage im Darm durch die chemische Zusammensetzung bestimmt wird, bildet die Zusammensetzung der EPS aus Glucose und Mannose eine ungemischte Wasserschicht im Darm, die die Aufnahme von Kohlenhydraten und Lipiden verringert. Lösliche Ballaststoffe sind daher bei der Behandlung von Diabetes einigermaßen wirksam, da sie den postprandialen Blutzuckeranstieg reduzieren können28. Die meisten von Meeresbakterien produzierten EPS haben OH- und COO-Gruppen, die ihnen eine vorübergehende negative Ladung und saure Eigenschaften verleihen. Die meisten marinen EPS sind im Allgemeinen linear, haben unterschiedliche Längen und haben eine mittlere Molekularmasse von 1 × 105 bis 3 × 105 g/mol29. In den letzten Jahren wurde berichtet, dass EPS-sekretierende hydrothermale Tiefseebakterien ein hohes Molekulargewicht von bis zu 1 × 106 g/mol haben, häufig sauer sind und Uronsäure in einer Konzentration von ~ 30 % enthalten.

Eine besondere Form der Gehirnerkrankung ist die Alzheimer-Krankheit. Sie wird durch eine Schädigung der Neuronen des Gehirns, bei denen es sich um Nervenzellen handelt, verursacht. Die Neuronen im Gehirn sind für alle menschlichen Aktivitäten notwendig, einschließlich Gehen, Sprechen und Denken. Die ersten Neuronen, die bei Alzheimer geschädigt werden, sind diejenigen in Gehirnregionen, die an Gedächtnis, Sprache und Denken beteiligt sind. Daher sind Gedächtnis-, Sprach- und Denkprobleme häufig die ersten Symptome. Obwohl diese Symptome für die betroffene Person neu sind, geht man davon aus, dass die Gehirnveränderungen, die sie verursachen, 20 Jahre oder länger vor dem Auftreten der Symptome begonnen haben30. Alter, Genetik, Kopfverletzungen, Gefäßerkrankungen, Infektionen und Umweltvariablen wie oxidativer Stress, Schwermetalle, Spurenmetalle und Gehirnentzündungen gelten unter anderem als Risikofaktoren für die Alzheimer-Krankheit (AD). Es ist derzeit nicht bekannt, was die pathologischen Veränderungen bei der Alzheimer-Krankheit verursacht (A, NFTs und synaptischer Verlust). Als Ursache für AD wurden mehrere Hypothesen vorgeschlagen, zwei davon gelten jedoch als Hauptursache: Einige glauben, dass eine Beeinträchtigung der cholinergen Funktion ein kritischer Risikofaktor für AD ist, während andere eine Veränderung der Amyloid-β-Protein-Produktion vermuten Die Verarbeitung ist der wichtigste auslösende Faktor. Derzeit gibt es jedoch keine allgemein anerkannte Theorie zur Pathogenese von AD31.

Derzeit sind weltweit etwa 24 Millionen Menschen an Alzheimer erkrankt, und Experten gehen davon aus, dass sich diese Zahl bis zum Jahr 2050 vervierfachen wird. Obwohl AD ein Problem der öffentlichen Gesundheit ist, sind derzeit nur zwei Arten von Medikamenten zur Behandlung von AD zugelassen: Cholinesterase-Enzym-Inhibitoren (natürlich vorkommende, synthetische und hybride Analoga) und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Antagonisten32. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Naturstoffe eine neuroprotektive Wirkung haben, weshalb sie seit langem als Therapeutika zur Behandlung verschiedener degenerativer Erkrankungen eingesetzt werden. Sowohl in In-vitro- als auch In-vivo-Studien wurde gezeigt, dass natürliche Substanzen therapeutisches Potenzial für AD bieten, sodass einige von ihnen in die Phase der klinischen Erprobung übergehen konnten. Die erste natürliche Substanz, die in klinischen Studien zur Behandlung von Alzheimer eingesetzt wurde, war Nikotin. In der Folge stießen weitere Substanzen, darunter die Vitamine C, E und D, aufgrund ihrer schützenden Wirkung gegen Neuroinflammation und oxidative Schäden zunehmend auf Interesse. Kürzlich wurde Bryostatin, ein Makrolidlactonextrakt aus dem Bryozoen Bugula neritina, evaluiert und zeigte die Fähigkeit, die α-Sekretase-Aktivität zu induzieren, die Aβ-Produktion zu reduzieren und das Lernen und Gedächtnis in einem AD-Mäusemodell zu verbessern33. Andere in der Volksmedizin (traditionelle chinesische Medizin) verwendete Naturstoffe haben vielversprechende Ergebnisse bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit gezeigt, indem sie auf mehrere Mechanismen wirken34.

In der vorliegenden Studie wurden die antioxidativen Kapazitäten von BMEPS aus B. maritimus MSM1 bewertet. Im Allgemeinen zeigte BMEPS dort gute antioxidative Eigenschaften; (i) neutralisierte freie Radikale (DPPH. und ABTS+), (ii) abgefangenes RS (O2− und NO), (iii) chelatisierte Fe+2-Ionen und (iv) gehemmte Lipidperoxidation im Vergleich mit zwei Referenzmaterialien LAA und BHT. Dementsprechend wurden die antioxidativen Eigenschaften natürlicher Polysaccharide in mehreren Studien dokumentiert. Unsere Studie wurde durch Ibrahim et al.14 Ergebnisse zu EPSs aus Adansonia digitate, El-Newary et al.6, saures EPS aus marinem B. amyloliquefaciens 3MS 2017, saures EPS aus Bacillus sp., gestützt. NRC57.

Abhängig von seiner chemischen Zusammensetzung könnten die antioxidativen Eigenschaften von BMEPS diskutiert werden. Die antioxidative Aktivität der natürlichen Polysaccharide wird durch mehrere Faktoren beeinflusst, darunter strukturelle Eigenschaften, die Anzahl der aktiven Gruppen (OH, COOH und SO4), den Sulfatgehalt und die Bindungsposition, Molekulargewichtsverknüpfungen und das Molekulargewicht35. Die antioxidativen Eigenschaften des aktuellen Polysaccharids (PS) könnten in Abhängigkeit von vielen Achsen wie folgt erklärt werden: Auf der ersten Achse ist der Monosaccharidgehalt von PS mit antioxidativen Eigenschaften verbunden, insbesondere mit Rhamnose und Mannose36. Die zweite Achse, der Typ der Glykosylbindungen, spielt eine wesentliche Rolle bei den antioxidativen Eigenschaften, insbesondere Arabinose (1–4) und Mannose (1–2) der Seitenkette, die stark mit der Reduktionsfähigkeit verknüpft sind, während Glucose (1–6) stark mit der reduktiven Fähigkeit verknüpft ist ) und Arabinose (1–4) stehen in engem Zusammenhang mit der Radikalfängeraktivität von DPPH37. Die dritte Achse, Uronsäuren in saurem PS, machen sie zu wirksamen Antioxidantien38 und Uronsäuren übten in der folgenden Reihenfolge eine vielversprechende Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale und zur Reduktion aus: Polygalaktouronsäure > Glucuronsäure > Galaktouronsäure38. Die vierte Achse, das Molekulargewicht, hat einen starken Einfluss auf die antioxidativen Kapazitäten, wobei Polysaccharide mit niedrigem Molekulargewicht Molekülen mit hoher Masse überlegen sind. PS mit niedrigem Molekulargewicht verfügt über eine starke Reduktionskraft zur Neutralisierung freier Radikale. Xing et al.39 zeigten, dass Chitosan mit einem niedrigen Molekulargewicht (9 kDa) eine bessere O2−-Fängerwirksamkeit aufweist als Chitosan mit einem hohen Molekulargewicht (760 kDa). Darüber hinaus verfügen Reispolysaccharide mit niedrigem Molekulargewicht über eine vielversprechende Reduktionskraft, Metallchelatbildung und die Fähigkeit, freie Radikale abzufangen. Die fünfte Achse besteht aus angehängten Funktionsgruppen. Sulfatierte Polysaccharide mit niedrigem Molekulargewicht wie Ulva pertusa-Polysaccharide haben bessere antioxidative Fähigkeiten als das sulfatierte Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht PS40. Schließlich steigerten Sulfatgruppen die Fähigkeit sulfatierter Polysaccharide als Fänger freier Radikale, als Metallchelatbildner und zur Hemmung der Bildung von Lipidperoxidation38. Polysaccharide mit hohem Sulfatgehalt waren wirksamer als solche mit niedrigem41. Das Abfangen freier Radikale von Materialien erfolgt durch Elektronentransfer oder Wasserstoffabgabe von den antioxidativen Materialien an dieses Radikal, um eine stabile Form zu erhalten24. Das PS kann Wasserstoffatome abgeben, da Wasserstoffbrückenbindungen niedrige Dissoziationsenergien haben. Aufgrund der Position des Schwefels in den sulfatierten Polysacchariden sind die Wasserstoffbrückenbindungen von Polysacchariden schwach. Außerdem fingen Sulfatgruppen von sulfatiertem PS freie Radikale elektrostatisch ein42. Die sechste Achse ist der pH-Wert. Die antioxidativen Fähigkeiten von sauren Polysacchariden mit niedrigem Molekulargewicht sind besser als die von sauren Polysacchariden mit hohem Molekulargewicht43. Gemäß der zuvor erwähnten Struktur-Aktivitäts-Beziehung könnte vermutet werden, dass die antioxidativen Eigenschaften von BMEPS mit seinem niedrigen Molekulargewicht (4,31 × 104 g/mol), Uronsäuren (24,7 %), Sulfat (18,3 %), Zusammensetzung von Monosacchariden; Mannuronsäure, Glukuronsäure, Glucose und Mannose in einem Molverhältnis von jeweils 0,8:1,0:2,8:2,3.

Diese Studie zeigte die selektive entzündungshemmende Wirkung von BMEPS gegen COX-2 im Vergleich zu COX-1. Die erzielten Ergebnisse stimmten mit denen von Ibrahim et al.14 zum Adansonia-Digital-Polysaccharid, El-Newary et al.6 zum sauren EPS aus B. amyloliquefaciens 3MS 2017 und Mohamed et al.7 zum sauren EPS aus Bacillus sp NRC5 überein.

Die Hauptfaktoren der Entzündungsreaktion lassen sich wie folgt zusammenfassen: (i) Stickoxid (NO) und Prostaglandinsynthese, (ii) NF-Kappa-B-Expression, (iii) reaktive Sauerstoffspezies (ROS), (iv) Migration von Leukozyten und schließlich (v) die proinflammatorischen Zytokine, also TNF, IL6 und IL144. Die entzündungshemmende Wirkung von BMEPS, wenn es in einem In-vivo-Modell getestet wird, könnte durch seine Wirkung auf oxidativen Stress, insbesondere die NO- und ROS-Fängerfähigkeit, erwähnt werden, die in dieser Studie aufgezeichnet wurde. In der aktuellen Studie zeigte BMEPS ein gutes Abfangen freier Radikale; NRS und ROS, Metallchelatbildung, Reduktionskraft und Wirksamkeit der Hemmung der Lipidperoxidation. BMEPS reduzierte die NO-Konzentration deutlich, was wiederum das Fortschreiten der Entzündung in vivo reduziert und kontrolliert. Außerdem neutralisierte BMEPS Superoxidradikale erheblich, was wiederum die NO-Toxizität verringerte.

Darüber hinaus zeigte BMEPS eine Anti-Cholinesterase-Aktivität gegen AChE oder BChE. Mehrere Polysaccharide haben eine AChE-hemmende Wirkung. Beispielsweise Proteoglucan (PGM) aus Pilzen45, EPSs aus L. delbrueckii subsp. bulgaricus B3 und L. plantarum GD246, EPSs, hergestellt aus der braunen Makroalge Ecklonia radiata47. Im Einklang damit zeigten Park et al.48, dass aus Ecklonia cava hergestelltes sulfatiertes Polysaccharid durch H2O2 induzierte kompetitive und nichtkompetitive Suppressoreffekte auf die Acetylcholinesterase in PC12-Zellen zeigte. Darüber hinaus reduzierten sulfatierte Polysaccharide, die aus Meeresalgen wie E. maxima, G. pristoides, U. lactuca, U. rigida und G. gracilis hergestellt wurden, die Acetylcholinesterase-Aktivität in behandelten Zellen mit Zn (50 μM) allein deutlich49,50 .

Andererseits wird AChE erheblich durch die Toxizität von Metallen wie Ze und Cu beeinflusst. In einem Experiment an Fisch Leporinus obtusidens (Piava) führte die Exposition gegenüber Zink und Kupfer zu einer signifikanten Aktivierung von AChE51. Außerdem führte die Exposition von Zebrafischen gegenüber ZnCl2 von mehr als 1 ppm zu einem Alzheimer-ähnlichen Syndrom, einschließlich Unterdrückung von ACh, vermindertem Bewegungsverhalten und Beeinträchtigung des Kurzzeitgedächtnisses aufgrund der Aktivierung durch AChE. Darüber hinaus induziert ZnCl2 die Konzentration von Amyloid-β und phosphoryliertem Tau-Protein im Gehirn52. Daher könnte das Einfangen überschüssiger dieser Metalle aus Medien AChE hemmen und den ACh-Gehalt im synaptischen Bereich erhöhen. In dieser Studie zeigte BMEPS die Fähigkeit zur Metallchelatbildung, was der Grund dafür sein könnte, dass es bei In-vivo-Anwendungen anticholinerg wirkt. Andererseits können sulfatierte Verbindungen mit der anionischen Stelle von AChE reagieren und deren Aktivität reduzieren48, was bedeutet, dass das in dieser Studie verwendete sulfatierte Polysaccharid auf diese Weise teilweise seine hemmende Wirkung auf AChE entfalten könnte.

Der andere Mechanismus, der in dieser Studie untersucht wurde, ist der Tyrosinase-Weg. Es gibt viele Tyrosinasehemmer, sowohl synthetischer als auch natürlicher Herkunft. Zu den Mechanismen der Tyrosinase-Hemmung gehören einer oder mehrere der folgenden: (i) Dopaquinon-Reduktion wie Ascorbinsäure, (ii) o-Dopaquinon-Fänger wie in thiohaltigen Verbindungen53, (iii) Kupfer-Chelatbildung, die die Tyrosinase-Aktivität aufgrund der Kupferstruktur von Tyrosinase als Kojisäure regulieren kann54 und (iv) H2O2-Fängermaterialien , wobei H2O2 die Tyrosinase aktivierte und als zweites Substrat diente55. Gemäß der zuvor dargelegten Erklärung könnten wir schlussfolgern, dass die Anti-Tyrosinase-Aktivität von BMEPS mit seiner Eigenschaft als Metallchelatbildner, H2O2-Fänger und seinem Gehalt an sulfatierten Gruppen zusammenhängt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aus Bacillus maritimus MSM1 hergestellte marine Exo-Polysaccharid durch physikalisch-chemische Analyse unter Verwendung von UV-, FTIR-, HPLC- und GPC-Analysen charakterisiert wurde. Diese Analysen bewiesen, dass es sich um ein sulfatiertes Polysaccharid mit niedrigem Molekulargewicht und Uronsubstitution (24,7 % bzw. 18,3 %) handelt und die Monosaccharide im Molverhältnis 0,8:1,0:2,8:2,3 für Mannuronsäure, Glukuronsäure, Glucose und Mannose vorliegen bzw. mit der Fülle an β-Konfigurationen. Das GPC schätzte das durchschnittliche Molekulargewicht (Mw) auf 4,31 × 104 g/mol. BMEPS zeigte vielversprechende antioxidative Eigenschaften und eine selektive Hemmwirkung gegen COX-2. Die nachgewiesene Wirksamkeit unterstützt den Einsatz dieses Polysaccharids als vielversprechendes Alternativmedikament bei der Behandlung entzündlicher und durch oxidativen Stress bedingter Erkrankungen. Darüber hinaus zeigt BMEPS Anti-Cholinesterase- und Anti-Tyrosinase-Aktivitäten, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind. Die vielversprechenden biologischen Eigenschaften von BMEPS können auf seinen Reichtum an SO3- und COO −-Gruppen, die β-glykosidische Bindung und sein niedriges Molekulargewicht zurückgeführt werden. Aus der Studie geht hervor, dass BMEPS ein Kandidat für weitere fortgeschrittene medizinische Studien als neuer natürlicher Rohstoff für Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit sein kann.

1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), Peroxidase, H2O2, ABTS (2,2-Azino-bis (3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure), Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween-20), Ascorbinsäure Säure (Vitamin C), Butylhydroxytoluol (BHT), Nicotinamidadenindinukleotid (NADH), Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT), Phenazinmethosulfat (PMS), Natriumnitroprussid (SNP), Sulfanilamid, ortho-H3PO4, Naphthylethylendiamindihydrochlorid, Diammoniumsalz , 3-(2-Pyridyl)-5,6-bis (4-phenylsulfonsäure)-1,2,4-triazin (Ferrozin), Eisenchlorid, Trichloressigsäure (TCA), Kaliumferricyanid, Leuco-2, 7-Dichlorfluoreszenzdiacetat, Hämatin, Arachidonsäure, Cyclooxygenasen-Enzyme (COX-1 vom Schaf, EC. 1.14.99.1 für COX-2), Acetylcholinesterase-Enzym, Acetylthiocholin-Jodid, DTNB, Butyrylthiocholin-Jodid, Butyrylcholinesterase-Enzym, Kojisäure , Tyrosinase-Enzym und L-Dopa wurden von Sigma-Aldrich, USA, bezogen. Ammoniumthiocyanat wurde von E. Merck bezogen. Alle Chemikalien und Lösungsmittel sind analysenrein.

Drei Proben wurden aus Meeressedimenten an verschiedenen Orten in Sahl Hashish, Hurghada, Rotes Meer, Ägypten, gesammelt.

Die gesammelten Proben (10 g) wurden in 100 ml steriles Meerwasser gegeben und durch 20-minütiges Schütteln bei 200 U/min homogenisiert, und es wurde eine Reihenverdünnung durchgeführt56. Schließlich wurden 50 μl des Überstands jeder Verdünnung auf Meeresnähragar inokuliert und die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien, die pro Platte jeder Probe auftraten, wurden einer Reinigung unterzogen. Die Produktion von EPS wurde durch die Bildung einer Schleimkolonie gezeigt, der die alkoholbasierte Ausfällung von EPS folgte. Frische Kulturen mariner Isolate wurden auf festes Agarmedium (g/L) aufgetragen: Glucose 20, CaCO3 0,1, NH4NO3 0,8, K2HPO4 0,6, KH2PO4 0,05, MnSO4.4H2O 0,1, Hefeextrakt 1,0 und Agar 15, und sie wurden separat bei inkubiert 37 °C. Die Bildung von Schleimkolonien wurde untersucht, indem 3 Tage lang das Vorhandensein schleimiger Schleimkolonien auf der Platte beobachtet wurde. Darüber hinaus wurden Schleifenkolonien in Alkohol getaucht, um die Ausfällung von EPSs zu beobachten. Wenn eine Kulturöse mit vorgekühltem absolutem Ethanol gemischt wird, fallen Kolonien aus der Lösung aus, was den EPS-Produzenten bestätigt.

Die Isolate wurden in einem modifizierten MY-Medium mit 75 % Meerwasser auf die Produktion von EPSs untersucht. Das Medium besteht aus (g/L): Pepton 4,0, Hefeextrakt 2,0 und Saccharose 20,0, pH 757. Das Medium wurde in einem Erlenmeyerkolben von 250 ml mit 50 ml Arbeitsvolumen verteilt. Die Kolben wurden autoklaviert und mit einer aktiv wachsenden Kultur beimpft und 3 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Die fermentierte Brühe wurde gesammelt und 30 Minuten lang bei 5000 U/min und 4 °C bei Sigma-Laborzentrifugen, 2K15, zentrifugiert, um Bakterienzellen zu entfernen. TCA (5 %) wurde hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C belassen, dann wurde es bei 5000 U/min zentrifugiert, um Protein58 zu entfernen. Der pH-Wert der klaren Lösung wurde mit 0,1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und das rohe EPS wurde durch Zugabe von 4 Volumina vorgekühltem absolutem Ethanol zur überstehenden Flüssigkeit ausgefällt; Dies wurde über Nacht bei 4 °C gelagert. Die Probe wurde dann zentrifugiert und nach dem Abdekantieren der Ethanollösung wurde das gewonnene Pellet erneut in entionisiertem Wasser aufgelöst. Das gelöste Roh-EPS wurde einem weiteren Fällungsschritt mit vorgekühltem absolutem Ethanol unterzogen, gefolgt von der anschließenden Zentrifugation und Dekantierung des Ethanols wie oben beschrieben. Das erhaltene Pellet wurde dann in einem Minimum an entionisiertem Wasser erneut aufgelöst und dreimal (1000 ml × 3) gegen fließendes Leitungswasser unter Verwendung eines Dialyseschlauchs (Cut-off-MWCO 3500 Da) 24 Stunden lang dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde einer fraktionierten Fällung mit 1, 2, 3 und 4 Volumina vorgekühltem absolutem Ethanol unterzogen. Die Hauptertragsfraktion aus 1 Volumen absolutem Ethanol wurde unter Vakuum bei 40 °C getrocknet59. Das UV-Absorptionsspektrum wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (2401PC Shimadzu, Japan) zwischen 200 und 800 nm aufgezeichnet, um das Vorhandensein von Proteinen und Nukleinsäuren zu untersuchen3. Die Hauptfraktion von EPS aus 1 Volumen Ethanol (BMEPS) wurde in vitro auf Acetylcholinesterase-Hemmung getestet.

Das vielversprechende Isolat (S16), das große Mengen an EPS und Acetylcholinesterase-Inhibitor produzierte, wurde anhand der biochemischen, morphologischen und physiologischen Eigenschaften des potenziellen Produzenten identifiziert, die mithilfe von Standardmethoden bestimmt wurden.60,61 Der Stamm wurde mit dem 16S-Ribosomal bestätigt RNA-Gensequenz und Vergleich mit anderen Bakteriensequenzen mithilfe von NCBI BLAST. Die taxonomische Zugehörigkeit der Sequenzen wurde aus dem Klassifikationsprogramm des Ribosomal Database Project62,63 abgerufen.

Die genomische DNA der Isolate wurde mit dem Bacterial Genomic DNA Extraction Kit extrahiert. Der Verstärkungsprozess dauerte insgesamt 2:35. Auf einem 0,8 %igen Agarosegel, das mit einem DNA-sicheren Farbstoff gefärbt war, waren die PCR-Produkte zu sehen. Schließlich wurden die PCR-Produkte sequenziert und die erhaltenen Sequenzdaten mithilfe der BLAST-Software (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) anhand der 16S-ribosomalen RNA-Sequenzdatenbank analysiert , mit der Software mega

Das 16S-rRNA-Genfragment wurde mithilfe von Blastn mit der NCBI-Nukleotiddatenbank verglichen. Die folgende bakterielle 16S-rDNA aus taxonomisch charakterisierten Homologen wurde aus der Genbank-Datenbank auf NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) gesammelt und für die phylogenetische Analyse verwendet.

BMEPS (50 mg) wurde 4 Stunden lang bei 100 °C in einem verschlossenen Röhrchen einer Hydrolyse mit 6 N HCl unterzogen. In einem Wasserbad bei 40 °C wurde die HCl entfernt und (1 ml × 3) mit Wasser co-destilliert64. Uronsäuren wurden mithilfe des m-Hydroxybiphenyl-Verfahrens auf 525 nm geschätzt. Sulfat im Hydrolysat wurde nach der Dodgson-Methode65 bewertet. Die Hydrolysat-Monozucker wurden mit der Agilent HPLC-Modellreihe 1100 (Agilent USA)6 analysiert.

Die UV-Vis-Spektroskopie wurde mit dem 2401PC UV-Vis-Spektrophotometer Shimadzu, Japan, im Wellenlängenbereich von 190–700 nm durchgeführt. FTIR wurde im Bereich von 400–4000 cm−1 auf einem Vector 22 Spektrophotometer Bucker14 gemessen.

Das gewichtsmittlere Molekulargewicht (Mw) des BMEPS wurde mithilfe der Hochleistungs-Gelpermeationschromatographie (HP-GPC) unter Verwendung eines Systems der Agilent HPLC1100-Serie gemäß You et al.55 gemessen.

Die Fe3+-reduzierende Wirkung von BMEPS wurde nach der Methode von Oyaizu66 untersucht und mit BHT und Ascorbinsäure als Referenzmaterialien verglichen. Aufeinanderfolgende Konzentrationen aus Polysaccharid und Standardmaterialien; Butylhydroxytoluol (BHT) und Ascorbinsäure (LAA) wurden in Mengen von 100, 250, 500, 750 und 1000 µg/ml in Methanol zubereitet. Die als IC50 ausgedrückte Aktivität wurde durch Log-Probit-Analyse berechnet.

Die Fe2+-Chelatisierungsaktivität von BMEPS wurde nach der Methode von Dinis et al.67 geschätzt und durch Vergleich mit zwei Standardverbindungen (BHT und Ascorbinsäure unter den gleichen Bedingungen) bewertet. Der Prozentsatz der Hemmung der Bildung des Ferrozin-Fe2+-Komplexes wurde durch die Formel angegeben:

Dabei war A0 die Absorption der Kontrolle und A1 die Absorption in Gegenwart der Polysaccharidprobe und Standards.

Nach der Methode von Yamaguchi et al.23 wurde die freie Radikalfängeraktivität von BMEPS unter Verwendung von 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH•) bestimmt. Gemäß der folgenden Gleichung wurde die Radikalfängeraktivität von DPPH berechnet:

wobei A0 die Absorption der Kontrolle und A1 die Absorption in Gegenwart von MBES war.

Basierend auf der von Miller und Rice-Evans68 beschriebenen Methode und einer Modifikation von Arnao et al.69 wurde die ABTS-Radikalkationen-Fängeraktivität von BMEPS geschätzt. Die Radikalkationen-Fängeraktivität von ABTS wurde wie folgt berechnet:

Die Fähigkeit von BMEPS, die Lipidperoxidation zu hemmen, wurde nach der Methode von Gülçin et al.70 bestimmt. Die prozentuale Hemmung der Lipidperoxidation wurde nach folgender Gleichung berechnet:

wobei A1, A2, A3 und A4 die Absorption der Probe am 1. Tag, 2., 3. und 4. Tag waren.

Die Messung der Superoxidanionen (O2−)-Fängeraktivität von BMEPS basierte auf der von Liu et al.71 beschriebenen Methode. Die O2−-Fängung wurde anhand der folgenden Formel berechnet:

Dabei war A0 die Absorption der Kontrolle und A1 die Absorption von Polysaccharid- oder Standardproben.

Unter Verwendung von Natriumnitroprussid (SNP) wurde die NO•-Radikalfängeraktivität von BMEPS bestimmt. NO• wird aus SNP in einer wässrigen Lösung bei physiologischem pH-Wert erzeugt, um Nitritionen zu erzeugen, die mit dem Greiss-Reagenz72 gemessen wurden.

Die Cyclooxygenase-Inhibitionsaktivität von BMEPS wurde gemäß Larsen et al.73 durchgeführt und Celecoxib wurde als Standardverbindung verwendet.

Beurteilung der Hemmung von Acetylcholinesterase (AchE) und Butyrylcholinesterase (BChE).

Die enzymatische Aktivität von BMEPS wurde mit der Methode von Ingkaninan74 analysiert. Die prozentuale Hemmung wurde nach folgender Formel berechnet:

Der Tyrosinase-Hemmungstest von BMEPS wurde gemäß den Methoden von Liu et al.75 durchgeführt. Die Anti-Tyrosinase-Fähigkeit von BMEPS wurde mit Kojisäure (Sigma, St. Louis, MO, USA) verglichen. Der Prozentsatz der Tyrosinase-Hemmung wurde wie folgt berechnet:

Die Daten wurden als Median ± SE dargestellt. In-vitro-Antioxidantiendaten wurden durch t-Test in einer einfachen ANOVA (n = 3 Replikate) unter Verwendung der Software MIB-SPSS, 25.0 analysiert. Der P-Wert lag unter 0,05.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Dieses Projekt wurde vom Nationalen Forschungszentrum Ägypten durch das Projekt Nr. 11010319 (2016–2019) mit dem Titel „Naturprodukt zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit; Alternativer Ansatz“.

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB). Die aktuelle Studie wurde vom Nationalen Forschungszentrum Ägypten im Rahmen des Projekts Nr. finanziell unterstützt. 11010319 (2016–2019) mit dem Titel „Naturprodukte zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit; Alternativer Ansatz“. Es wurden keine weiteren Mittel von einer anderen Partei erhalten, die sich direkt oder indirekt auf die Ergebnisse auswirken könnten.

Abteilung für mikrobielle Biotechnologie, Institut für biotechnologische Forschung, Nationales Forschungszentrum, Gizeh, 12622, Ägypten

Manal S. Selim, Sahar S. Mohamed, Mohsen S. Asker und Mohamed E. El Awady

Forschungsabteilung für Heil- und Aromapflanzen, Forschungsinstitut für Pharma- und Arzneimittelindustrie, Nationales Forschungszentrum, Gizeh, 12622, Ägypten

Abeer Y. Ibrahim und Samah A. El-Newary

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MSS, SSM, MSA und MEE produzierten Exopolysaccharide und führten deren Charakterisierung durch, verfassten diese Daten und überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt. AYI konzipierte und betreute hauptsächlich die Arbeit und überarbeitete das Manuskript. SAE und AYI führten antioxidative, entzündungshemmende und Anti-Alzheimer-Biomarker durch. AYI und SAE analysierten diese Daten, verfassten und überarbeiteten das Manuskript.

Korrespondenz mit Mohamed E. El Awady.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Selim, MS, Mohamed, SS, Asker, MS et al. Charakterisierung und In-vitro-Alzheimer-Eigenschaften von Exopolysacchariden aus Bacillus maritimus MSM1. Sci Rep 13, 11399 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38172-z

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Eingegangen: 26. März 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 14. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38172-z

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