Das Nicht

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 10342 (2023) Diesen Artikel zitieren

1519 Zugriffe

12 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) ist ein tödlicher tierischer Krankheitserreger, der durch Endozytose in seine Wirtszellen gelangt. Bisher wurden kaum Wirtsfaktoren identifiziert, die speziell für die ASFV-Replikation erforderlich sind. In dieser Studie zeigte ein genomweites CRISPR/Cas9-Knockout-Screening in Schweinezellen, dass die Gene RFXANK, RFXAP, SLA-DMA, SLA-DMB und CIITA für eine produktive ASFV-Infektion wichtig sind. Die von diesen Genen kodierten Proteine ​​gehören zum Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC II) oder Schweine-Leukozyten-Antigen-Komplex II (SLA II). RFXAP und CIITA sind MHC II-spezifische Transkriptionsfaktoren, wohingegen SLA-DMA/B Untereinheiten des nicht-klassischen MHC II-Moleküls SLA-DM sind. Das gezielte Ausschalten eines dieser Gene führte zu schwerwiegenden Replikationsdefekten verschiedener ASFV-Isolate, was sich in einer erheblich verringerten Ausplattierungseffizienz, der Ausbreitung von Zelle zu Zelle, den Virustitern der Nachkommen und der viralen DNA-Replikation widerspiegelte. Die transgenbasierte Rekonstitution von SLA-DMA/B stellte die Replikationskapazität vollständig wieder her, was zeigt, dass SLA-DM, das sich in späten Endosomen befindet, in den frühen Phasen der ASFV-Infektion eine entscheidende Rolle spielt.

Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) ist der Erreger der Afrikanischen Schweinepest (ASF), einer hämorrhagischen Erkrankung von Hausschweinen und Wildschweinen (Art Sus scrofa)1,2,3. ASFV wurde erstmals 1921 in Kenia identifiziert und wird seitdem in den meisten afrikanischen Ländern südlich der Sahara gemeldet4,5. Durch teilweise Sequenzierung des Gens B646L, das für das Hauptkapsidprotein p72 kodiert, wurden 24 Genotypen von ASFV spezifiziert6,7. Bisher wurden nur zwei von ihnen, Genotyp I und Genotyp II, außerhalb Afrikas nachgewiesen, wobei Genotyp II für die aktuelle Panzoose verantwortlich ist. Seit der Einschleppung von ASPV in Georgien im Jahr 2007 wurden ASP-Ausbrüche in Ländern der europäischen Region, der Russischen Föderation, Asien, Ozeanien und Amerika gemeldet3,8,9 (OIE-Wahis-Website, besucht im November 2022). In den meisten betroffenen Ländern beschränkt sich die Bekämpfung der ASP immer noch auf Maßnahmen zur Biorisikobewältigung, Überwachungsansätze und Reaktionsstrategien, zu denen auch Keulungen und Handelsbeschränkungen gehören, und führt zu erheblichen Wirtschafts- und Produktionsverlusten, da zugelassene Impfstoffe derzeit nicht im Handel erhältlich sind3.

ASFV is the only member of the genus Asfivirus of the family Asfarviridae10,11,12, (2020)." href="/articles/s41598-023-36788-9#ref-CR13" id="ref-link-section-d8432881e574"> 13. Sein lineares doppelsträngiges DNA-Genom variiert zwischen 170 und 193 kbp in der Größe und enthält 150 bis 167 vorhergesagte proteinkodierende offene Leserahmen14,15,16. Die Existenz von 134 viralen Proteinen wurde bestätigt, die Funktionen vieler von ihnen sind jedoch noch unbekannt oder konnten nur anhand von Sequenzhomologien vorhergesagt werden17,18,19,20,21. ASFV-Partikel enthalten etwa 82 virale Proteine, sind etwa 250 nm groß und mehrschichtig. Sie bestehen aus einer äußeren Lipidmembran, einem ikosaedrischen äußeren Kapsid, einer inneren Lipidmembran, einem inneren Kapsid, einer dicken Proteinkernhülle und einem Nukleoid, das das Genom enthält18,19,22,23.

ASFV-Partikel gelangen entweder durch Dynamin- und Clathrin-vermittelte Endozytose24,25 oder durch Makropinozytose26,27 in ihre Wirtszelle. Sobald ASFV-Partikel internalisiert wurden, wandern sie über den gesamten endolysosomalen Weg. Direkt nach der Infektion können sie in frühen Endosomen oder Makropinosomen durch Elektronenmikroskopie und durch Kolokalisation viraler Proteine ​​mit spezifischen endosomalen Markern (EEA1 und Rab5)26 nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten wird ASFV in späten Endosomen oder Lysosomen gefunden, die mit CD63, Rab7, Lamp1 und Cathepsin kolokalisieren26,28. Während dieses Transports durchlaufen ASFV-Partikel umfangreiche strukturelle Veränderungen, die dazu führen, dass Virionen in multivesikulären späten Endosomen keine Außenmembranen und Außenkapside mehr haben. Die freigelegte innere Hülle der ASFV-Partikel verschmilzt dann mit der endosomalen Membran, was zur Freisetzung nackter Kernpartikel in das Zytoplasma führt26. Nach einem kurzen und wenig verstandenen Initiationsschritt im Zellkern finden die virale DNA-Replikation und die Viruspartikelmorphogenese im Zytoplasma in perinukleären Virusfabriken neben dem Mikrotubuli-Organisationszentrum statt29. Für die Bildung von Nachkommen-Viruspartikeln werden Membranen erworben, die aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) stammen, und intrazelluläre Virionen, die aus dem Genom bestehen, das den inneren Kern, das innere Kapsid, die innere Hülle und das äußere Kapsid enthält, werden zusammengesetzt30,31,32,33. Diese intrazellulären Virionen werden dann entlang von Mikrotubuli zur Zellperipherie transportiert und erhalten ihre äußere Lipidmembran durch Knospung aus der Plasmamembran34,35,36. Sowohl die intrazellulären Virionen als auch die doppelt umhüllten Virionen sind infektiös32.

Als obligater intrazellulärer Krankheitserreger ist ASFV für seine Replikation auf den Stoffwechsel und die Proteine ​​der Wirtszelle angewiesen. Der Eintrittsprozess von ASFV ist beispielsweise temperatur-, energie- und cholesterinabhängig 37,38. Es erfordert die Aktivität von Dynamin, Rac1, Pak1, Rab7, endosomalen Membranen mit Phosphoinositiden, die durch Phosphatidylinositol-Kinasen (PI3K oder PIKfyve) synthetisiert werden, und die Ansäuerung der Endosomen25,26,27,28,39,40,41. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Aufhebung des endosomalen Proteins Niemann Pick C1 (NPC1) oder des lysosomalen Membranproteins 1 (Lamp-1) die ASFV-Infektion teilweise hemmte. Da eine vollständige Hemmung nicht erreicht wurde, wurde spekuliert, dass zusätzliche endosomale Proteine ​​bei diesem Schritt der ASFV-Replikation eine Rolle spielen könnten42.

Die CRISPR/Cas9-Technologie bietet Methoden zur Identifizierung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen in unvoreingenommenen Hochdurchsatzansätzen43. In der Vergangenheit wurde diese Technologie bereits verwendet, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die für die Replikation von z. B. Influenzaviren, Flaviviren, Noroviren, Schmallenbergviren, humanen Immundefizienzviren, Hepatitis-C-Viren und japanischen Enzephalitisviren relevant sind44,45,46,47,48,49 ,50,51. Darüber hinaus wurde mithilfe einer neu entwickelten Lentivirus-basierten CRISPR/Cas9-Bibliothek, die auf das Schweinegenom abzielt (SsCRISPRko.v1), ein neuer Wirtsfaktor identifiziert, der für die Replikation des Schweine-Alphaherpesvirus-Pseudorabiesvirus (PrV) erforderlich ist52.

In dieser Studie wurde die CRISPR-knockout Single Guide RNA (sgRNA)-Bibliothek, die auf alle annotierten Gene des Schweinegenoms (Sus scrofa) abzielt, für ein genomweites Screening verwendet, um zelluläre Faktoren zu identifizieren, die für die ASFV-Replikation relevant sind. Unsere Studien ergaben, dass der Ausfall von fünf Expressionsfaktoren und Membranproteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes II (MHC II), auch Schweine-Leukozyten-Antigen-Komplex II (SLA II) genannt, eine reproduktive ASFV-Infektion nahezu aufhebt. Insbesondere das heterodimere nichtklassische MHC II-Protein SLA-DM erwies sich als entscheidend für die ASFV-Replikation.

Um Wirtsgene und ihre jeweiligen Proteinprodukte zu identifizieren, die für die ASFV-Replikation in kultivierten Schweinezellen erforderlich sind, wurde ein genomweites CRISPR/Cas9-Screening mit der zuvor beschriebenen und charakterisierten Schweine-CRISPR/Cas9-Knockout-Bibliothek SsCRISPRko.v1 durchgeführt52. Die Bibliothek kodierte 83.381 sgRNAs, darunter 1.001 nicht zielgerichtete Kontroll-sgRNAs, und 82.380 spezifische sgRNAs, die auf 20.598 Schweinegene mit drei bis vier sgRNAs pro Gen abzielten. Die sgRNA-Sequenzen wurden in den Vektor lentiCRISPRv2 kloniert, der auch eine Expressionskassette für Cas9 und ein Puromycin-Resistenzgen zur Selektion bereitstellt.

Diese Bibliothek wurde in defekte Lentivirus-Partikel gepackt, die dann zur Transduktion hochpassagierter Wildschweinlungenzellen (WSL) verwendet wurden, die eine effiziente Replikation vieler nativer oder adaptierter ASFV-Isolate unterstützen53,54. Um die Integration nur eines sgRNA-Gens in das Genom einer einzelnen Zelle sicherzustellen, wurde eine niedrige Transduktionsmultiplizität (MOT) von 0,3 gewählt. Puromycin-resistente Zellen, die Cas9 und einzelne sgRNAs mutmaßlich stabil exprimierten, wurden über zwei Wochen vermehrt. Zu diesem Zeitpunkt wurden etwa 6 × 107 Zellen der Gesamtzahl von etwa 4 × 108 Zellen pro Experiment als nicht infizierte Kontrollen für die DNA-Präparation aufbewahrt. Die verbleibenden Zellen wurden erneut ausgesät und mit dem rekombinanten ASFV Kenya 1033 ΔCD2v dsRed55,56 des Genotyps IX bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,3 oder 0,5 infiziert. Der fluoreszierende Expressionsmarker erleichterte den Nachweis einer erfolgreichen Infektion. Ein progressiver zytopathischer Effekt (CPE) war ab 48 Stunden nach der Infektion und nach ca. 2 Stunden nach der Infektion nachweisbar. Nach etwa vier bis fünf Wochen wurden Zellkolonien sichtbar, die aus einzelnen überlebenden Zellen entstanden waren. Diese Zellen wurden in zwei Teilmengen zusammengefasst. Teile dieser Pools wurden als „Überlebende 1–1“ und „Überlebende 1–2“ für die DNA-Präparation gespeichert. Die anderen Teile wurden erneut besät und infiziert, und nach ca. Drei Wochen lang konnten „Überlebende 2–1“ und „Überlebende 2–2“ geerntet werden. Die Aussaat und Infektion der Zellen wurde viermal wiederholt, um sicherzustellen, dass alle Zellen dem Virus ausgesetzt waren. Die wiederholten Infektionen waren notwendig, da festgestellt wurde, dass ASFV Kenya zwar einen sehr ausgeprägten CPE in WSL-Zellen induzierte, jedoch nicht immer in der Lage war, alle nicht transduzierten Kontrollzellen während einer Replikationsrunde zu lysieren. Um Fehltreffer durch versehentlich überlebende Zellen weiter auszuschließen, wurde das Screening-Verfahren nicht nur mit zwei Zelluntergruppen, sondern auch in zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt.

Für jedes Screening wurde die DNA der Kontrolle (Zellen vor der Infektion) und der Überlebenden (Zellen nach der Infektion) der beiden Untergruppen parallel isoliert und die integrierten sgRNA-Genregionen in drei aufeinanderfolgenden PCRs mit geeigneten Primern amplifiziert (Ergänzungstabelle S1). ) für die Ion Torrent-Sequenzierung. Die Sequenzierungsdaten wurden mit der MAGeCK-Algorithmussoftware analysiert, die testet, ob sich die Häufigkeit von sgRNA-Genen zwischen behandelten Zellen (Überlebenden) und Kontrollen signifikant unterscheidet, und angereicherte sgRNA-Sequenzen identifiziert, die auf bestimmte genomische Loci abzielen, mit der Berechnung der robusten Ranking-Aggregation (RRA)57.

Mit dieser Analyse wurden die sgRNAs, die auf SLA-DMB, LOC100736732, RFXAP, SLA-DMA, LOC106509697, RFXANK und LOC100624181 abzielen, mit den niedrigsten RRA-Werten (d. h. am höchsten) unter den besten zehn Treffern der positiv ausgewählten Gene in allen vier Untergruppen gefunden die beiden Bildschirme (Abb. 1a, b, Ergänzungstabelle S2). Für alle diese Gene wurde mehr als eine spezifische sgRNA im überlebenden Zellpool erhöht gefunden (Ergänzungstabellen S2 und S3). Darüber hinaus wurde das Gen CCZ1 aus den zehn besten Treffern der Screens in drei Untergruppen identifiziert, während die Gene LOC102165390, TMEM30A und VPS33A in einem der Screens gefunden wurden und die Gene MARCO, LYPD4 und VPS18 unter der ersten zehn Treffer in nur einer der Teilmengen (Abb. 1a, b, Ergänzungstabellen S2 und S3). Die Proteinprodukte der meisten der letztgenannten Gene sind an Endozytose- und/oder Autophagiewegen beteiligt und werden in zukünftigen Studien weiter analysiert.

Genomweite CRISPR/Cas9-Knockout-Screens identifizierten Moleküle des MHC II-Signalwegs als relevant für die ASFV-Replikation. (a) Diagramme der RRA-Scores (Robust Rank Aggregation), die von der MAGeCK-Algorithmussoftware aus vier separaten Analysen berechnet wurden, die in zwei unabhängigen Bildschirmen ermittelt wurden. Der sgRNA-Gehalt der Kontrollzellen wurde mit der sgRNA-Häufigkeit von Zellen verglichen, die vier aufeinanderfolgende ASFV-Infektionen überlebten. (b) Mittlere (−) und einzelne RRA-Scores der einzelnen Gentreffer in den vier verschiedenen Analysen. Dunkelblaue Punkte stellen sgRNAs gegenüber den angegebenen Genen (x-Achse) dar, die in 4/4 Untergruppen gefunden werden. Mittelhellblaue Punkte stellen die sgRNAs gegen das Gen CCZ1 dar, die in 3/4 Untergruppen gefunden wurden. Hellblaue Punkte zeigen sgRNAs, die nur in den beiden Teilmengen der durchgeführten Screens gefunden wurden. (c) Schematische Darstellung eines MHC-II-Genlocus (z. B. für SLA-DMA oder SLA-DMB) mit dem MHC-Klasse-II-spezifischen regulatorischen SXY-Modul und spezifischen Transkriptionsfaktoren. Proteine, die im genomweiten CRISPR/Cas9-Knockout-Screen als entscheidender zellulärer Faktor für die ASFV-Infektion identifiziert wurden, sind blau dargestellt.

Diese Studie konzentriert sich auf die Rolle von Wirtsgenen, die in allen vier Untergruppen mit sehr niedrigen Werten identifiziert wurden (SLA-DMB, LOC100736732, RFXAP, SLA-DMA, LOC106509697, RFXANK und LOC100624181). Bemerkenswerterweise hängen sie alle mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC II/SLA II) zusammen (Abb. 1c). RFXANK kodiert für das regulatorische Faktor-X-assoziierte Ankyrin enthaltende Protein (RFXANK) und RFXAP kodiert für das regulatorische Faktor RFXANK, RFXAP und der regulatorische Faktor Zusammen mit anderen Faktoren dienen sie als Landeplatz für den MHC-Klasse-II-Transaktivator (CIITA)58. CIITA wurde durch erhöhte sgRNAs gegen LOC100736732, LOC106509697 und LOC100624181 identifiziert. RFXAP, RFXANK und CIITA sind für die Transkriptionsaktivität von MHC-Klasse-II-Promotoren von großer Bedeutung58. Schließlich wurden in beiden Screens die Gene SLA-DMA und SLA-DMB identifiziert, die für die Alpha- und Betaketten des nichtklassischen Klasse-II-Schweineleukozytenantigens DM (SLA-DM) kodieren und mit deren Hilfe transkribiert werden -genannte Faktoren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mehrere Hinweise darauf hinweisen, dass der MHC II-Signalweg ein äußerst relevanter Wirtsfaktor für die ASFV-Replikation ist.

Um die Bedeutung des MHC II-Expressions- und Präsentationswegs für den Replikationszyklus von ASFV zu verifizieren, wurden gezielte Gen-Knockouts in einen neu isolierten Einzelzellklon der WSL-Zelllinie eingeführt. Um das Risiko zu minimieren, dass die Ergebnisse durch inhärente genetische Unterschiede beeinflusst werden könnten, wurde ein Klon von WSL-Zellen verwendet. Für den gezielten Knockout wurden die Gene, die für das nicht-klassische MHC II-Molekül SLA-DM, SLA-DMA und SLA-DMB kodieren, sowie zwei Gene, die für die Transkription von MHC II wichtig sind, RFXAP und CIITA (LOC100736732), verwendet ausgewählt.

Für den Knockout wurde eine der vier sgRNA-Sequenzen der Schweinebibliothek ausgewählt (Ergänzungsabbildung S1, dunkelblau; Ergänzungstabelle S4) und in den sgRNA- und Cas9-Doppelexpressionsvektor pX330A-1 × 4neoRA kloniert. WSL-Zellen wurden mit den erhaltenen Plasmiden transfiziert, seriell verdünnt und auf G418-Resistenz selektiert. Resistente Einzelzellklone wurden vermehrt und durch Immunblotting auf Cas9-Expression überprüft. Anschließend wurde die DNA von Cas9-positiven Zellen isoliert und die korrekte Integration des sgRNA-Gens durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung mit geeigneten Primern verifiziert (Ergänzungstabelle S5). Darüber hinaus wurden PCR-Analysen mit Primern durchgeführt, die für die Zielgenregionen von SLA-DMA, SLA-DMB, RFXAP und CIITA spezifisch sind (Ergänzungstabelle S5). Nach der Sequenzanalyse der Amplifikationsprodukte wurden WSL-Knockout-Zellklone (WSLKO) mit schädlichen Nukleotidinsertionen oder -deletionen (INDELs) in SLA-DMA (Klone 11, 12, 16), SLA-DMB (Klone 9, 16, 18) und CIITA identifiziert (Klone 1, 4, 8) oder RFXAP (Klone 6, 8) wurden ausgewählt (ergänzende Abbildung S2). Der Zellklon WSL SLA-DMAKO (11) zeigte eine 823 nt lange Insertion mit Stoppcodons in allen Leserahmen, die vom Transfervektor pX330A-1×4neoRA abgeleitet ist. Die Klone WSL SLA-DMAKO (12) und (16) sowie WSL SLA-DMBKO (9) weisen Deletionen von 1 nt auf, die zu Frameshifts und vorzeitigen Stoppcodons führen (ergänzende Abbildung S2). Im Gegensatz dazu weisen WSL SLA-DMBKO (16) und (18) eine identische Insertion von 1 nt (T) auf, die direkt ein Stoppcodon (TGA) erzeugt. Die Zellklone WSL CIITAKO (1), (4) und (8) zeigten Deletionen von 1, 5 bzw. 23 Nukleotiden, was zu Leserahmenverschiebungen und vorzeitiger Beendigung führte. WSL RFXAPKO (6) zeigte eine Insertion von 1 nt (C), die zu einem stromabwärts gelegenen Terminationscodon (TGA) führte, und in WSL RFXAPKO (8) war eine Insertion mit Stopcodon von 140 nt aus dem Vektor pX330A-1×4neoRA zu sehen gefunden (Ergänzende Abbildung S2). Bemerkenswerterweise wurden bei allen ausgewählten Zellklonen nur einzelne PCR-Produkte erhalten, die eindeutige Sequenzen der mutierten Gene aufwiesen, was entweder auf identische biallelische Veränderungen oder auf große Deletionen in den anderen Allelen, einschließlich der Primerbindungsstellen, hinweist. Wildtyp-Sequenzen der sgRNA-Zielregionen wurden nie beobachtet.

Frühere Studien zeigten, dass WSL-Zellen das MHC II-Protein SLA-DR an ihrer Oberfläche exprimieren54. Dies wurde durch indirekte Immunfluoreszenzanalysen (IF) von nicht permeabilisierten Zellen unter Verwendung eines SLA-DR-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAb) verifiziert (Abb. 2a). Während SLA-DR auf der Oberfläche der Eltern-WSL-Zellen und der Knockout-Zellen WSL SLA-DMAKO und WSL SLA-DMBKO nachweisbar war, war es auf RFXAP- und CIITA-Knockout-Zellen nicht sichtbar (Abb. 2a). Dies bestätigte, dass RFXAP und CIITA wesentliche Faktoren für die MHC II-Transkription sind.

Eltern-WSL- und WSL-Knockout-Zellen unterscheiden sich in der Expression von MHC II-Proteinen. (a) Indirekte Immunfluoreszenzanalysen der Zelloberflächenexpression von SLA-DR in WSL-, WSL SLA-DMAKO-, WSL SLA-DMBKO-, WSL CIITAKO- und WSL RFXAPKO-Zellklonen. Balken: 30 µm. (b) Massenspektrometrieanalyse der quantitativen Expressionsniveaus des Housekeeping-Gens α-Tubulin (TUBA4A-ENSSSCG00000016216), der Gene des MHC II-Signalwegs (SLA-DRA-ENSSSCG00000001453, SLA-DRB1-ENSSSCG00000001455, SLA-DQA-ENSSSCG00000001456, SLA -DQB-ENSSSCG00000001457) und des MHC I-Signalwegs (SLA-8-ENSSSCG00000001231, HLA-E-ENSSSCG00000001229) in WSL und angezeigten Knockout-Zellen basierend auf markierungsfreier Quantifizierung (LFQ). Die Daten stellen Mittelwerte aus drei Replikaten dar. Graue Felder zeigen an, dass die entsprechenden Proteine ​​nicht nachgewiesen wurden. (c) Vergleichende quantitative Analyse der Proteinexpressionsniveaus in WSL und einzelnen WSLKO-Zellklonen. Proteine ​​sind durch Punkte gekennzeichnet. Schwarze Punkte stellen Proteine ​​dar, die an der Antigenverarbeitung und -präsentation beteiligt sind. Soweit nachgewiesen, sind die in b dargestellten SLA I/II-Proteine ​​rot hervorgehoben.

Zur Charakterisierung der Knockouts auf Proteomebene wurden die Proteingehalte der Knockout-Zelllinien mittels Massenspektrometrie (MS) analysiert (Abb. 2b, c). Von den 5495 identifizierten und quantifizierten Proteinen wurden 4874 in allen Zellklonen nachgewiesen (Ergänzungstabelle S6). Die Proteinzusammensetzung aller Zellklone war sehr ähnlich, was durch das Fehlen einer klaren Clusterbildung der Replikate nach der Hauptkomponentenanalyse (PCA) angezeigt wurde (ergänzende Abbildung S3). Leider war in den MS-Analysen weder in Knockout- noch in normalen WSL-Zellen eine SLA-DM-Expression nachweisbar. Allerdings unterdrückte ein einmaliger Knockout von RFXAP oder CIITA die Synthese anderer identifizierter MHC II-Proteine ​​(SLA-DR, SLA-DQ) unterhalb der Nachweisgrenzen und beeinflusste auch die Expression von MHC I (SLA-8, HLA-E). Die Expression dieser Proteine ​​​​blieb in WSL SLA-DMAKO- und WSL SLA-DMBKO-Zellen unbeeinflusst (Abb. 2b, c).

Bevor getestet wird, ob sich ASFV in Zellen vermehren kann, denen Moleküle des MHC-II-Signalwegs fehlen, sollten unspezifische Nebenwirkungen dieser Knockouts auf die Lebensfähigkeit und die Anfälligkeit für andere Virusinfektionen ausgeschlossen werden. Zu diesem Zweck wurden die Eltern-WSL, WSL SLA-DMAKO (Klone 11, 12, 16), WSL SLA-DMBKO (Klone 9, 16, 18), WSL CIITAKO (Klone 1, 4, 8) und WSL RFXAPKO (Klone 6) verwendet , 8) Zellen wurden mit einer GFP-exprimierenden Mutante des porzinen Alphaherpesvirus-Pseudorabiesvirus (PrV) infiziert. Die Studien ergaben, dass sich weder die Plattierungseffizienz noch die Plaquegrößen oder Nachkommenvirustiter von PrV signifikant zwischen den WSL-Elternzellen und den getesteten Knockout-Zelllinien unterschieden (ergänzende Abbildung S4). Dies zeigte, dass die Knockout-Zellen per se zur Vermehrung eines Schweinevirus geeignet sind.

Zur ASFV-Infektion der Zellen wurden zwei verschiedene Virusstämme verwendet. Neben dem parentalen Genotyp-IX-Stamm der für das Bibliotheksscreening verwendeten Virusrekombinante (ASFV Kenya 1033) wurde auch eine Variante des aktuellen panzootischen Genotyp-II-Virus einbezogen (ASFV Armenia 2008). Eltern-WSL- und Knockout-Zellklone wurden mit seriellen Verdünnungen beider Viren infiziert. Nach 4 Tagen unter halbfestem Medium wurden die Zellen fixiert und infizierte Zellen und Virusplaques wurden durch IF-Detektion des ASFV-Kapsidproteins p72 sichtbar gemacht. Die Fluoreszenzmikroskopie ergab, dass beide Stämme deutlich mehr WSL-Elternzellen infizieren konnten als alle Knockout-Zellen (Abb. 3a). Die berechneten Plattierungseffizienzen aller getesteten WSLKO-Zellen wurden im Vergleich zu WSL-Zellen deutlich auf <4 % reduziert (Abb. 3b). Darüber hinaus wurden die Plaqueflächen bei ASFV Armenia in WSLKO-Zellen im Vergleich zur Plaquegröße des jeweiligen Virus auf der Elternzelllinie signifikant auf weniger als 14 % und bei ASFV Kenya auf weniger als 10 % reduziert (Abb. 3c). Eine schwerwiegende Beeinträchtigung der ASFV-Replikation wurde auch in mehrstufigen (MOI 0,02) Wachstumsstudien beobachtet. Während sich ASFV Armenia in WSL-Zellen bis zu maximalen Titern von 1,8 × 107 PFU/ml 168 Stunden nach der Infektion (pi) replizierte, lagen die Titer in Knockout-Zellen zwischen 1,2 × 104 PFU/ml in WSL SLA-DMBKO (18) und 3,8 × 104 PFU/ml in WSL RFXAPKO (8) (Abb. 3d). Der Endtiter von ASFV Kenya in WSL-Zellen betrug 2,0 × 107 PFU/ml, während die Titer in Knockout-Zellen von 1,2 × 105 PFU/ml in WSL SLA-DMAKO (16) bis 1,23 × 106 PFU/ml in WSL RFXAPKO reichten ( 8) Zellen (Abb. 3d). Somit wurden die Titer für ASFV Armenia um 3 Logs verringert und die Titer für ASFV Kenya wurden beim WSL-Knockout im Vergleich zu Elternzellen um mindestens 1,5 Logs reduziert. Darüber hinaus zeigte sich, dass die produktive ASFV Armenia-Replikation in Knockout-Zellen nach 72 h pi ein Plateau erreichte, während die Titer von ASFV Kenya bis 120 h pi anstiegen. Dies könnte darauf hindeuten, dass die wenigen erfolgreich mit ASFV Kenya infizierten Knockout-Zellen in der Lage sind, mehr zu produzieren infektiöses Virus über einen längeren Zeitraum als mit ASFV Armenia infizierte Zellen, was mit etwas höheren Titern von ASFV Kenya übereinstimmen würde, die bei normalen WSL-Zellen beobachtet werden.

Die ASFV-Replikation in WSL-Knockout-Zellen ist beeinträchtigt. (a) Visualisierung von mit ASFV Armenia oder ASFV Kenya infizierten WSL- und WSLKO-Zellen (grün) und Nukleinsäuren (blau) durch Immunfluoreszenzfärbung. Repräsentative Bilder der angegebenen Zellklone, die mit verschiedenen Virusverdünnungen (10–1 bis 10–3) infiziert wurden, um die Ausplattierungseffizienz und Plaquegrößen zu veranschaulichen. Balken: 100 µm. (b) Die Ausplattierungseffizienz von ASFV Armenia und ASFV Kenya wurde durch Zählen von ASFV-infizierten Zellen oder Plaques in drei unabhängigen Experimenten (n = 3) berechnet. Dargestellt sind mittlere relative scheinbare Titer (%) im Vergleich zu denen auf WSL-Zellen und Standardabweichungen. Signifikante Unterschiede wurden durch eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA und anschließend durch den Tukey-Mehrfachvergleichstest berechnet. **** = p < 0,0001. (c) Zur Bestimmung der Plaquegrößen wurden Flächen von fünfzig Plaques pro Zelllinie aus drei unabhängigen Experimenten (n = 150) gemessen und die mittleren relativen Flächen (%) im Vergleich zu WSL-Zellen einschließlich Standardabweichungen angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden durch den Kruskal-Wallis-Test und anschließend durch den Mehrfachvergleichstest nach Dunn berechnet. **** = p < 0,0001. (d) Mehrstufige (MOI 0,02) Wachstumskurvenanalyse von ASFV Armenia oder Kenya in WSL- und WSLKO-Zellen. Dargestellt sind die mittleren Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten (n = 3) mit Standardabweichungen.

Neben der Analyse infektiöser Virusnachkommen in infizierten Zelllysaten wurde auch die virale DNA-Replikation untersucht (Abb. 4). Zu diesem Zweck wurden parentale WSL-Zellen und ausgewählte WSLKO-Zellklone mit ASFV Armenia bei einer MOI von 3 infiziert und bei 0, 2, 4, 8, 16 und 32 h pi geerntet. Die Gesamt-DNA wurde vorbereitet und zur Bestimmung der Kopienzahlen des ASFV-Genoms verwendet durch Duplex-TaqMan-qPCR-Reaktionen zum Nachweis des viralen B646L-Gens und des β-Actin-Gens der Wirtszelle als interne Kontrolle (Abb. 4). B646L-spezifische Sonden zeigten nach 4 Stunden moderat erhöhte DNA-Mengen und eine exponentielle Replikationsphase bis 8 Stunden pi in parentalen WSL-Zellen. Zu einem späteren Zeitpunkt verlangsamte sich die virale DNA-Replikation und führte zu 2,8 × 107 Genomkopien in den analysierten Proben (enthaltend DNA von ca. 1 × 104 Zellen) nach 32 Stunden pi. Ein verzögerter Beginn der DNA-Replikation wurde bei allen WSLKO-Zellklonen beobachtet, was zu … ein moderater Anstieg der Genomkopienzahlen zwischen 8 h pi und 16 h pi. Von 16 h pi bis zum Ende des Experiments blieb die virale DNA-Menge nahezu konstant und reichte von 1,2 × 105 ASFV-Genomen in SLA-DMBKO (9)-Zellen bis 6,8 × 105 ASFV-Genome in RFXAPKO (8)-Zellen. Da die Kopienzahlen des ASFV-Genoms in allen getesteten WSLKO-Zellen zu allen analysierten Zeitpunkten erheblich niedriger waren, sind die gelöschten Wirtsproteine ​​offensichtlich für einen Schritt vor dem Beginn der Virusgenomreplikation wichtig.

Die ASFV-DNA-Replikation wird in WSL-Knockout-Zellen gehemmt. Eltern-WSL- und WSLKO-Zellen wurden mit ASFV Armenia bei einer MOI von 3 infiziert und nach den angegebenen Zeiten wurden die Mengen an ASFV-DNA durch Echtzeit-qPCR quantifiziert, die auf das virale B646L-Gen abzielte. Die Anzahl der Genomkopien wurde unter Verwendung von Plasmidstandards bestimmt. Die Diagramme stellen Mittelwerte zweier biologischer Replikate mit Standardabweichungen dar.

Um weiter zu klären, welche Schritte des Virusreplikationszyklus nach dem Ausschalten der MHC-II-bezogenen Gene blockiert sein könnten, wurden WSL-, WSL-SLA-DMAKO- (11) und WSL-CIITAKO- (1) Zellen 16 Stunden nach der Infektion elektronenmikroskopisch (EM) analysiert mit ASFV Armenia bei einem MOI von 5 (Abb. 5). Reife extrazelluläre Viruspartikel, intrazelluläre Partikel und Virusfabriken wurden nur in den WSL-Elternzellen nachgewiesen, wohingegen in keiner der Knockout-Zellen Spuren der ASFV-Replikation gefunden wurden. Diese Ergebnisse deuten auch auf eine Funktion der ausgeschalteten Wirtszellproteine ​​in den ersten Schritten der Virusreplikation hin, was mit der erheblich verringerten Plattierungseffizienz und Genomkopienzahl von ASFV in WSLKO-Zellen im Einklang steht.

ASFV-Nachkommenviruspartikel werden in infizierten WSL-Elternzellen nachgewiesen, nicht jedoch in Knockout-Zellen. (a–d) WSL-, (e) WSL SLA-DMAKO- und (f) WSL CIITAKO-Zellen wurden 16 Stunden nach der Infektion mit ASFV Armenia bei einer MOI von 5 fixiert und elektronenmikroskopisch analysiert. Virusfabriken (Pfeil), intrazellulär ( *) und extrazelluläre Viruspartikel (#) sind angegeben. Balken repräsentieren 1 µm (a, e, f) oder 200 nm (b, c, d).

Um zu testen, ob die beobachtete Hemmung der ASFV-Replikation in SLA-DM-Knockout-Zellen tatsächlich auf das Fehlen der jeweiligen Proteine ​​zurückzuführen ist, wurden WSL-SLA-DMAKO- (11) und SLA-DMBKO-Zellen (9) stabil mit SLA-DMA oder SLA transformiert -DMB-Expressionskassetten. Die Nukleotidsequenzen der offenen Leserahmen wurden in den sgRNA-Zielregionen durch die Einführung stiller Nukleotidveränderungen codonoptimiert und modifiziert, um eine Inaktivierung der Transgene durch die noch integrierte CRISPR/Cas9-Maschinerie der Knockout-Zellen auszuschließen (Ergänzende Abb. S5). . Die synthetischen Gene wurden mit und ohne Tags (StrepII, Myc) in Lentivirus-Expressionsvektoren kloniert, was zu pLV-SLA-DMA, pLV-SLA-DMA-Myc, pLV-SLA-DMA-Strep, pLV-SLA-DMB und pLV führte -SLA-DMB-Myc und ein GFP-Expressionskonstrukt (pLV-GFP), das als Kontrolle dient. Eltern-WSL-Zellen wurden mit allen generierten Vektoren transduziert; SLA-DMAKO (11)-Zellen wurden entweder mit pLV-SLA-DMA, pLV-SLA-DMA-Myc, pLV-SLA-DMA-Strep oder pLV-GFP transduziert, und SLA-DMBKO (9)-Zellen mit pLV-SLA- DMB, pLV-SLA-DMB-Myc oder pLV-GFP und stabil transformierte Zellen wurden unter Verwendung von Puromycin enthaltendem Medium selektiert. Anders als in den WSL- und Knockout-Elternzellen waren markierte Proteine ​​der erwarteten Größe durch Western Blot in den WSL-Knockout/Knockin-Zellen (WSLKO/KI) nachweisbar (Abb. 6). Leider wurden die nicht markierten SLA-DMA- und -DMB-Proteine ​​von den verfügbaren Antikörpern gegen humanes Leukozytenantigen (HLA)-DMA und HLA-DMB nicht erkannt. Dennoch wurden diese Zelllinien in die Analyse der ASFV-Infektion einbezogen, da die C-terminal hinzugefügten Tags die Reifung oder die Bildung heterodimerer Komplexe zwischen den transgenkodierten und den nicht betroffenen endogenen Alpha- oder Betaketten von SLA-DM beeinträchtigen könnten.

WSL-Knockout/Knockin-Zellen exprimieren MHC II-Transgene. Lysate von (a) WSL-SLA-DMAKO-Zellen und (b) WSL-Zellen, die die angegebenen SLA-DMA-Transgene oder GFP exprimieren, oder Lysate von (c) SLA-DMBKO-Zellen und (d) WSL-Zellen, die die angegebenen SLA-DMB-Transgene oder GFP exprimieren durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembranen übertragen und mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine ​​oder Protein-Tags untersucht. Die Molekülmassen der Markerproteine ​​(in kDa) sind links angegeben. Original-Blots sind in der ergänzenden Abbildung 6a – d dargestellt.

In transduzierten SLA-DMAKO (11)-Zellen stieg die Ausplattierungseffizienz von ASFV Armenia und Kenya auf etwa 77 % bzw. 86 % der Titer in parentalen WSL-Zellen nach Wiedereinführung von authentischem SLA-DMA (SLA-DMAKO-DMAKI) (Abb . 7a). In SLA-DMAKO-DMA-MycKI-Zellen wurden 42 % (Armenien) bzw. 50 % (Kenia) und in SLA-DMAKO-DMA-StrepKI-Zellen 79 % (Armenien) bzw. 90 % (Kenia) der ursprünglichen Titer erreicht. In WSL-SLA-DMBKO-DMBKI-Zellen wurden Ausplattierungseffizienzen von 77 % (Armenien) und 94 % (Kenia) und in SLA-DMBKO-DMB-MycKI-Zellen Ausplattierungseffizienzen von 63 % (Armenien) und 56 % (Kenia) beobachtet ( Abb. 7a). In den meisten Fällen waren die scheinbaren Virustiter auf verschiedenen WSLKO/KI-Zellen nicht signifikant niedriger als auf Eltern-WSL-Zellen (Abb. 7a). Somit hatten die hinzugefügten Tags offensichtlich keinen (StrepII) oder nur geringfügigen Einfluss (Myc) auf die vorgeschlagene Funktion von SLA-DM für die ASFV-Replikation. Weitere statistische Analysen der beobachteten Unterschiede zwischen den Beschichtungseffizienzen bei Knockout-, Knockin- und Knockout/Knockin-Zellklonen sind in den Zusatzinformationen aufgeführt.

Die Expression des MHC II-Transgens in WSL-Knockout/Knockin-Zellen stellte die ASFV-Replikation wieder her. (a, b) Zur Bestimmung der Plattierungseffizienz und der Plaquegröße wurden mit ASFV Armenia oder ASFV Kenya infizierte WSL-, WSLKO- und WSLKO/KI-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. (a) Die Ausplattierungseffizienz von ASFV Armenia und ASFV Kenya wurde durch Zählen von ASFV-infizierten Zellen oder Plaques in drei unabhängigen Experimenten (n = 6) berechnet. Dargestellt sind die mittleren relativen (%) Titer im Vergleich zu denen auf WSL-Zellen sowie Standardabweichungen. Signifikante Unterschiede wurden durch eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA und anschließend durch den Tukey-Mehrfachvergleichstest berechnet. * = p < 0,05, **** = p < 0,0001, ns = nicht signifikant. (b) Zur Bestimmung der Plaquegrößen wurden Flächen von fünfzig Plaques pro Zelllinie aus drei unabhängigen Experimenten (n = 150) gemessen und die mittleren relativen (%) Größen im Vergleich zu WSL-Zellen einschließlich Standardabweichungen angezeigt. Signifikante Unterschiede wurden durch den Kruskal-Wallis-Test und anschließend durch den Mehrfachvergleichstest nach Dunn berechnet. *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001, ns = nicht signifikant. (c–e) Mehrstufige (MOI 0,02) Wachstumsanalyse von ASFV Armenia und Kenya in unbehandelten und Transgen-exprimierenden Lentivirus-transduzierten (c) WSL-, (d) WSL-DMAKO- und (e) WSL-DMBKO-Zellen. Dargestellt sind die mittleren Ergebnisse zweier unabhängiger Experimente mit zwei Wiederholungen (n = 4) und Standardabweichungen.

Die stabile Transduktion von WSL SLA-DMAKO- und SLA-DMBKO-Zellen mit Expressionskassetten für die entsprechenden markierten oder nicht markierten Proteine ​​stellte auch die Ausbreitung von ASFV Armenia und ASFV Kenya von Zelle zu Zelle wieder her. In allen Fällen wiesen Plaques auf verschiedenen WSLKO / KI-Zellen ähnliche oder sogar größere Größen auf als auf den WSL-Elternzellen (Abb. 7b, ergänzende Abb. S6). Statistische Analysen der Plaquegrößenunterschiede zwischen den einzelnen Zellklonen sind in den Ergänzungstabellen S10 und S11 dargestellt.

Dementsprechend ergaben wachstumskinetische Studien, dass auf WSLKO/KI-Zellen die Virustiter der Nachkommen von ASFV Armenia und Kenya um etwa 1 % erhöht waren. 2,5 bzw. 1,5 log im Vergleich zu denen auf den Elternzellen (Abb. 7c – e), und die endgültigen Virustiter waren wiederum denen auf ursprünglichen WSL-Zellen ähnlich. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die schädlichen Auswirkungen von SLA-DMA/B-Knockout auf die Anfälligkeit für ASFV-Infektionen durch die Expression entsprechender Transgene vollständig rückgängig gemacht werden können, was eine entscheidende spezifische Rolle von SLA-DM bei der ASFV-Replikation zeigt.

Als intrazellulärer viraler Krankheitserreger benötigt ASFV trotz seines komplexen Genoms und Proteoms immer noch viele Wirtsfaktoren für die Ausbreitung. Mithilfe eines genomweiten CRISPR/Cas9-Knockout-Screenings in einer anfälligen Schweinezelllinie (WSL) identifizierten wir die Gene RFXAP, RFXANK, SLA-DMA, SLA-DMB und die für CIITA kodierenden Gene (LOC100736732, LOC106509697 und LOC100624181) als Spitzenkandidaten wichtig für die ASFV-Replikation. Die von diesen Genen kodierten Proteine ​​sind Teil des Expressions- und Präsentationswegs von MHC II (SLA II)58. Die gezielte Inaktivierung von RFXAP, CIITA, SLA-DMA und SLA-DMB hemmte die Replikation von ASFV-Stämmen der Genotypen II und IX, einschließlich des aktuellen panzootischen Virus-Genotyps, erheblich, was die Bedeutung bestimmter MHC II-Moleküle für die ASFV-Replikation in vitro bestätigte. Darüber hinaus stellte die Rekonstitution von SLA-DMA oder SLA-DMB in entsprechenden Knockout-Zellen deren ASFV-Replikationskapazität vollständig wieder her und weist auf eine entscheidende spezifische Rolle des MHC II-Moleküls SLA-DM während des viralen Lebenszyklus hin.

Der MHC II-Komplex ist bei Wirbeltieren hochkonserviert und wird bei Schweinen als SLA II und beim Menschen als HLA II bezeichnet. Schweine besitzen vier MHC II-Moleküle, SLA-DR, SLA-DQ, SLA-DO und SLA-DM59. SLA-DR und -DQ sind klassische MHC II-Transmembran-Zelloberflächen-Glykoproteine, die dem Antigenrezeptor von CD4+-Helfer-T-Zellen exogene Peptide präsentieren, während SLA-DM und -DO als nicht-klassische MHC II-Moleküle bezeichnet werden. Beim Menschen sind sie an der Regulierung der Beladung der klassischen MHC-Klasse-II-Moleküle mit antigenen Peptiden beteiligt. Alle MHC II-Proteine ​​sind Heterodimere, die aus α- und β-Ketten bestehen, und in klassischen MHC II-Proteinen bilden die a1- und b1-Domänen die Peptidbindungsfurche. Für den menschlichen Synthese- und Präsentationsweg wurde beschrieben60, dass die klassischen MHC II-α- und -β-Untereinheiten im ER synthetisiert werden, wo sie sich mit dem spezifischen Chaperon CD74/invariante Kette (li) zusammensetzen. Das Li fördert die MHC II-Faltung, verhindert eine vorzeitige Peptidbindung und sortiert die MHC II-Moleküle entweder direkt aus dem Trans-Golgi-Netzwerk oder durch Reinternalisierung von der Zelloberfläche in späte endosomale Kompartimente. Die saure Umgebung der Endosomen baut hauptsächlich Li ab, hinterlässt jedoch ein spezifisches Li-Fragment, das invariante kettenassoziierte Peptid der Klasse II (CLIP), in der MHC II-Bindungsfurche. Die Freisetzung von CLIP wird durch das nichtklassische MHC II-Molekül DM durch die Förderung einer Konformationsänderung induziert, wobei klassische MHC II-Proteine ​​mit antigenen Peptiden höherer Affinität beladen werden. Diese Peptide resultieren aus Antigenen, die durch Clathrin-vermittelte Endozytose, Phagozytose oder Mikropinozytose internalisiert wurden.

ASFV dringt über Clathrin-vermittelte Endozytose oder Makropinozytose in seine Wirtszellen ein. Wie MHC II DM, das über ein Tyrosinmotiv60 auf späte Endosomen abzielt, gelangt auch ASFV beim Eintritt in späte Endosomen24,25,26,27,28. Späte Endosomen stellen somit ein Zellkompartiment dar, in dem MHC II DM (SLA-DM)-Moleküle und ankommende ASFV-Partikel in unmittelbare Nähe kommen. Kürzlich wurde entdeckt, dass die endosomalen Proteine ​​NCP1 und LAMP-1/-2 mit den mutmaßlichen ASFV-Fusionsproteinen pE258R bzw. pE199L interagieren. Darüber hinaus führte der durch CRISPR/Cas9 induzierte Knockout von NCP1 zu einer Retention von ASFV-Partikeln in späten Endosomen. Darüber hinaus wurde eine Verringerung der ASFV-infizierten Zellen und eine Verringerung der Virusreplikation beobachtet. Da die ASFV-Infektion nur teilweise gehemmt wurde, wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Virus möglicherweise alternative endosomale Wirtsfaktoren nutzen kann42. In unserer Studie zeigten SLA-DMA- und SLA-DMB-Knockout-Zellen einen schwerwiegenden Defekt in der Anfälligkeit für eine ASFV-Infektion und der anschließenden DNA- und Virusreplikation. Dieser Effekt könnte durch die Wiedereinführung der entsprechenden SLA-DM-Untereinheiten umgekehrt werden, was darauf hindeutet, dass SLA-DM für den ASFV-Eintritt wichtig sein könnte, z. B. für eine effiziente Entfernung der Beschichtung und die Freisetzung von Kernpartikeln aus den späten Endosomen. Bedauerlicherweise scheiterten erste Versuche, ASFV in inokulierten SLA-DMAKO- und CIITAKO-Zellen mittels Elektronenmikroskopie zu lokalisieren, und es konnten keine Ansammlungen blockierter Partikel in den späten endosomalen Kompartimenten beobachtet werden, was möglicherweise auf ihren schnellen Abbau und die moderate MOI von 5 infektiösen Wildtyp-WSL zurückzuführen ist Einheiten pro Zelle. Das Fehlen viraler Fabriken und nachweisbarer Mengen an Nachkommen-Viruspartikeln in elektronenmikroskopischen Analysen von WSLKO-Zellen sowie die wesentlich verringerte Ausplattierungseffizienz und Genomkopienzahl von ASFV in WSLKO im Vergleich zu Wildtyp-Elternzellen weisen jedoch stark auf eine Infektion des MHC II hin -gelöschte Zellen werden sehr früh blockiert.

In den genomweiten CRISPR/Cas9-Knockout-Screens von WSL-Zellen, die gegen eine ASFV-Infektion resistent sind, waren auch sgRNAs, die auf RFXAP, RFXANK, LOC100736732, LOC106509697 und LOC100624181 abzielen, signifikant erhöht. Diese Gene kodieren für RFXAP, RFXANK und CIITA (LOC100736732, LOC106509697, LOC100624181). Zusammen mit RFX5 sind diese Moleküle an der Expression aller MHC II-Gene61,62,63,64,65 beteiligt. Unsere Studien ergaben, dass die ASFV-Infektion in CIITAKO- oder RFXAPKO-Zellen in ähnlichem Ausmaß gehemmt wurde wie in Knockout-Zellen ohne SLA-DMA oder SLA-DMB. Anders als in SLA-DMKO-Zellen wurde die MHC II-Expression im Allgemeinen in Zellen gehemmt, denen funktionelle CIITA- oder RFXAP-Gene fehlen. Dies wurde durch IF- und MS-Analysen gezeigt, bei denen die klassischen MHC II-Moleküle SLA-DR und SLA-DQ nicht nachgewiesen wurden, obwohl sie in parentalen WSL-Zellen vorhanden sind. Da CIITA und RFXAP allgemeine Regulatoren der MHC-II-Expression sind,58 ist es wahrscheinlich, dass den entsprechenden Knockout-Zellen auch die nicht-klassischen MHC-II-Moleküle SLA-DO und SLA-DM fehlen, die mit unseren verfügbaren Tools nicht nachgewiesen oder quantifiziert werden konnten. Obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass die regulatorischen Proteine ​​CIITA oder RFXAP oder SLA-DR, SLA-DQ und SLA-DO ebenfalls direkt an der ASFV-Infektion oder -Replikation beteiligt sind, scheint es wahrscheinlicher, dass SLA-DM das einzige relevante MHC II-Molekül ist . Dies wird durch die Tatsache untermauert, dass im durchgeführten CRISPR/Cas9-Knockout-Screen keine sgRNA-Treffer identifiziert wurden, die auf SLA-DR, SLA-DQ oder SLA-DO abzielen. Darüber hinaus zeigte die durchflusszytometrische Analyse anfälliger Zellen, dass die Expression des klassischen MHC-II-Moleküls SLA-DQ für eine ASFV-Infektion nicht wesentlich ist66. Im Gegensatz dazu wurden in einem CRISPR/Cas9-Knockout-Screen zur Entdeckung relevanter Wirtsfaktoren für das Fledermaus-Influenza-A-Virus neben den MHC-II-Transkriptionsfaktoren RFXANK, RFXAP, RFX5 und CIITA auch die klassischen MHC-II-Moleküle HLA-DRA und HLA-DRB1 identifiziert und nachgeschaltete Experimente bestätigt dass das MHC II-Molekül HLA-DR eine wesentliche Eintrittsdeterminante für Fledermaus-Influenza-A-Viren ist46.

Frühere Studien zeigten, dass eine ASFV-Infektion von Makrophagen die SLA-DMA- und SLA-DMB-Expression herunterreguliert, während die Expression von SLA-DOA/B hochreguliert wird67. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese ASFV-induzierte Herunterregulierung von SLA-DM neben der vorgeschlagenen Rolle bei der Immunevasion auch die erneute Infektion von Wirtszellen verhindern und dadurch die Effizienz der Virusvermehrung steigern könnte. Die Modulation der MHC II-vermittelten zellulären Immunantwort wurde auch für eine Infektion mit dem humanen Cytomegalievirus beschrieben, bei der das virale Protein pUS2 HLA-DMA und -DRA zerstört, um die Erkennung durch CD4 + T-Zellen zu verhindern68.

Die Expression von MHC II-Molekülen erfolgt überwiegend in professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) wie Makrophagen, B-Zellen und dendritischen Zellen sowie Thymusepithelzellen69,70,71. Darüber hinaus wurde die MHC II-Expression in verschiedenen Kapillarendothelien von Schweinen beschrieben72. Zunächst schien es überraschend, dass Moleküle des MHC-II-Signalwegs während unserer CRISPR/Cas9-Knockout-Screens in WSL-Zellen identifiziert wurden, bei denen es sich um eine permanente Zelllinie handelt, die aus der Lunge von Wildschweinen stammt. Allerdings zeigte eine frühere Charakterisierung von WSL-Zellen bereits, dass diese Zellen Proteine ​​exprimieren, die spezifisch für die Monozyten-/Makrophagen-Linie sind, darunter SWC3, CD14, CD169, CD163 und SLA II. Daher wurde spekuliert, dass WSL-Zellen aus der myeloischen Linie stammen und unreife Vorläufer von Makrophagen darstellen könnten54. Monozyten und Makrophagen, die zur Gruppe der APCs gehören, sind die Hauptzielzellen von ASFV in seinem Wirbeltierwirt73,74. Daher sollte in zukünftigen Studien versucht werden, die SLA-DM-Expression in Makrophagen beispielsweise mit siRNAs auszuschalten, um zu überprüfen, ob dies die ASFV-Replikation auch in seiner natürlichen Wirtszelle beeinflusst.

Funktionsverlust-CRISPR/Cas9-Screenings sind leistungsstarke Tools zur Identifizierung von Wirtsfaktoren, die für den Viruseintritt und für nachgelagerte Schritte der Virusreplikation erforderlich sind. Frühere Studien dieser Art identifizierten Zellproteine, die für die Replikation von Influenzaviren, Flaviviren, Noroviren, Lentiviren, Herpesviren und anderen entscheidend sind44,45,46,47,48,49,50,51,52. Mit den hier präsentierten Daten konnten wir erstmals zweifelsfrei zeigen, dass Komponenten des MHC II-Systems, insbesondere das nicht-klassische Membranprotein SLA-DM, zumindest in der Zellkultur für die ASFV-Replikation entscheidend sind. Weitere Forschung ist erforderlich, um im Detail zu klären, wie ASFV dieses Molekül der zellulären Immunantwort zu seinem eigenen Vorteil nutzt. Darüber hinaus muss untersucht werden, ob SLA-DM ein geeignetes Zielprotein für eine antivirale Behandlung oder die Entwicklung ASFV-resistenter Schweine sein könnte.

Die Zelllinien stammen aus der Zellkultursammlung für Veterinärmedizin (CCVM) des Friedrich-Loeffler-Instituts (FLI). Die hochpassagierte Wildschweinlungenzelllinie (WSL-R-HP, #1346; abgekürzt als WSL) wurde in Ham's F12-Zellkulturmedium (Ham's F-12, 5,32 g/L; IMDM, 8,80 g/L; NaHCO3, 2,45 g/L; pH 7,2), das mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt wurde. Die Klonierung der Zelllinie erfolgte durch limitierende Verdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen. Einzelne Zellen wurden vermehrt und ein WSL-Zellklon mit parentalem Phänotyp wurde ausgewählt und für alle gezielten Knockout-Experimente verwendet. Eine Kaninchennierenzelllinie (RK-13, #0237) wurde in Minimum Essential Medium (MEM; MEM-Eagle-Hank-Salz, 5,32 g/L; MEM Earle-Salz, 4,76 g/L; NaHCO3, 1,25) gehalten g/L; nicht-essentielle Aminosäuren, 1 %; Na-Pyruvat, 0,12 g/L; pH 7,2), ergänzt mit 10 % FCS. Die menschliche embryonale Nierenzelllinie (HEK293Td4.1, Nr. 1539) wurde ebenfalls in MEM, ergänzt mit 10 % FCS, gehalten. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 2,5 % CO2 inkubiert.

ASFV Armenia 2008 (ASFV Armenia), ein virulentes ASFV-Isolat vom Genotyp II aus Armenien55, wurde freundlicherweise von Sandra Blome (FLI) zur Verfügung gestellt. Das Virus wurde durch 21 serielle Passagen auf WSL-Zellen an ein effizientes Wachstum in Zellkulturen angepasst. Das Genotyp-IX-Isolat ASFV Kenya 103355,75 wurde freundlicherweise von Richard Bishop (International Livestock Research Institute, Nairobi, Kenia) zur Verfügung gestellt. Der mutierte ASFV Kenya 1033 ΔCD2v dsRed, der eine Reportergen-Expressionskassette am deletierten CD2v (EP402R)-Genlocus55,56 enthält, wurde freundlicherweise von Günther M. Keil (FLI) zur Verfügung gestellt. Als heterologes Kontrollvirus wurde die plasmidbasierte PrV-Mutante PrV-BaΔgGG76 verwendet.

Die Erzeugung und Charakterisierung der Schweine-CRISPR-Knockout-Bibliothek (SsCRISPRko.v1) wurde beschrieben52. Kurz gesagt, für die Erzeugung spezifischer Single Guide RNAs (sgRNA), die auf proteinkodierende Gene abzielen, wurde die Genomassemblierung S. scrofa 10.277 verwendet. Für jedes Gen wurden drei bis vier sgRNAs ausgewählt. Insgesamt bestand die Schweine-CRISPR-Bibliothek aus 83.381 spezifischen sgRNAs, die auf 20.598 Schweinegene abzielten, und 1001 nicht zielgerichteten Kontrollen, kloniert in das pLenti-CRISPRv2-Rückgrat (Addgen #52961).

Das genomweite CRISPR/Cas9-Knockout-Screening wurde wie zuvor beschrieben52 mit geringfügigen Modifikationen, wie unten beschrieben, durchgeführt.

In fünf 20-cm-Schalen wurden jeweils 5 × 106 WSL-Zellen einen Tag vor der Transduktion mit der lentiviralen sgRNA-Bibliothek ausgesät, die gemäß dem Protokoll von Joung et al.78 hergestellt wurde, bei einer MOT von 0,3 in einem Medium mit 10 µg/ml Polybren. Drei Tage nach der Transduktion wurden die Zellen in acht Schalen mit einer Dichte von 5 × 106 Zellen/Platte und einem Medium mit 1,25 µg/ml Puromycin aufgeteilt. Bei der Konfluenz wurden ausgewählte transduzierte Zellen erneut in insgesamt 16 Platten mit einer Dichte von 5 × 106 Zellen/Platte aufgeteilt. 12 Tage nach der Transduktion wurden die Zellen in 30 Schalen mit einer Dichte von 1 × 107 Zellen/Schale ausgesät, um sie am nächsten Tag zu infizieren. Zu diesem Zeitpunkt wurden mindestens 6 × 107 Zellen geerntet, sedimentiert und als Kontrollen zur DNA-Extraktion bei –20 °C gelagert. Die Infektion wurde mit ASFV Kenya 1033 ΔCD2v dsRed bei einer MOI von 0,3 oder 0,5 (abhängig von den verfügbaren Mengen an Virusbeständen) durchgeführt, da gezeigt wurde, dass diese MOI erforderlich ist, um zumindest die meisten infizierten WSL-Kontrollzellen abzutöten. Die Zellen wurden täglich auf Fluoreszenzmarker-Expression und zytopathische Wirkung überprüft und je nach Bedarf wurde Medium hinzugefügt oder gewechselt. Für den Mediumwechsel wurden 20 % konditioniertes Medium aus unbehandelten WSL-Zellen einbezogen. Nach ca. Vier bis fünf Wochen wachsende Zellkolonien von allen Platten wurden trypsiniert und in zwei gepoolte Untergruppen aufgeteilt. Mindestens 2 × 107 Zellen jeder Untergruppe wurden zur DNA-Präparation bei –20 °C gelagert. Die restlichen Zellen wurden erneut in Zellkulturschalen ausgesät und wie oben infiziert. Zellen, die die zweite Infektion überlebten, wurden ca. 20 Tage später. Die Zellsammlung zur DNA-Vorbereitung, Neuaussaat und Infektion wurde insgesamt viermal wiederholt. Das gesamte Screening-Verfahren wurde zweimal durchgeführt, was zu zwei Sätzen nicht infizierter Kontrollzellen und acht Überlebenspopulationen (zwei Sätze pro Screening) führte.

Zur zuverlässigen Virusinaktivierung wurden die sedimentierten Zellen in TEN (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl), ergänzt mit RNase A (500 µg/ml, Serva), resuspendiert und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert . Nach Zugabe von SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,3 % wurden die Proben 30 Minuten lang weiter bei 75 °C inkubiert, bevor das Standardprotokoll für Lyse und DNA-Extraktion unter Verwendung von Sarkosylpuffer, RNase A, Pronase, Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol ausgeführt wurde Niederschlag wie zuvor beschrieben52.

Um Sequenzierungsbibliotheken zu erstellen, wurden drei aufeinanderfolgende PCR-Amplifikationen der extrahierten DNAs durchgeführt. Zunächst wurden vier 50-µl-Reaktionen pro Probe mit 5 µg DNA, jeweils 25 fmol P5-Vorwärtsprimer (ITA2fwd_P5) und P7-Rückwärtsprimer (ITA2rev_P7_leCRV) (Ergänzungstabelle S1) und 3,75 U ExTaq-DNA-Polymerase (Clontech) vorbereitet nach Herstellerangaben. Die Inkubationsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 1 Minute, 28 Zyklen von 95 °C für 30 Sekunden, 53 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 1 Minute, 72 °C für 10 Minuten. Nach der Amplifikation wurden die vier PCR-Reaktionen jeder Probe gepoolt und die 155-bp-Produkte mit einem Gelextraktionskit (Zymo Research) gelgereinigt. Die DNA wurde in nukleasefreiem Wasser eluiert und 200 ng DNA wurden in einer zweiten PCR-Reaktion mit den gleichen Zutaten wie zuvor, jedoch mit jeweils 25 fmol eines probenspezifischen P5-Barcode-Forward-Primers (z. B. ITA2fwd_ID85_P5both) und P7-Reverse verwendet Primer (z. B. ITA2rev_IDxx_P7leCrv2) (Ergänzungstabelle S1). Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 1 Minute, 14 Zyklen von 95 °C für 30 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 1 Minute, 72 °C für 10 Minuten. PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAgen) gereinigt und in 35 µl nukleasefreiem Wasser eluiert. Ein dritter Amplifikationsschritt mit der gesamten eluierten DNA wurde in einem Volumen von 300 µl (6 × 50 µl) unter Verwendung der gleichen Verbindungen wie für die zweite PCR durchgeführt, außer einer zehnfach höheren Konzentration der Vorwärts- und Rückwärtsprimer (250 fmol). Die PCR-Reaktion wurde wie zuvor durchgeführt, jedoch nur für einen einzigen Zyklus. Die 222-bp-Amplifikationsprodukte wurden gelgereinigt und in nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Isolierung der DNA und die drei aufeinanderfolgenden PCR-Amplifikationen wurden für die gesamten Probensätze einschließlich der entsprechenden Kontrollen parallel durchgeführt, um Verzerrungen zu minimieren.

Die Proben wurden in einem IonTorrent Ion S5™ XL-System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) sequenziert und die Sequenzierungsdaten wurden auf der Galaxy-Webplattform (usegalaxy.eu) unter Verwendung von Cutadapt (Galaxy Version 1.16.5) und dem MAGeCK-Zähltool (Galaxy) verarbeitet und analysiert Version 0.5.8.4) und MAGeCK-Testtool (Galaxy-Version 0.5.8.1) wie beschrieben52,57,79,80. Die Sequenzierungsergebnisse von zwei verschiedenen Bedingungen („Kontrolle“ vs. „Überlebender“) wurden mithilfe der RRA-Methode (Robust Rank Aggregation) des MAGeCK-Testtools57 verglichen.

Für die gezielte Erzeugung von SLA-DMA-, SLA-DMB-, CIITA- oder RFXAP-Knockout-Zellen wurde eine der vier genspezifischen sgRNAs aus der gesamten Genombibliothek ausgewählt (ergänzende Abbildung S1 und Tabelle S4) und in den Multiplex CRISPR/Cas9 kloniert Vektor pX330A-1×4, der ein Geschenk von Takashi Yamamoto war (Addgene-Plasmid # 58768; http://n2t.net/addgene:58768; RRID:Addgene_58768)81 und der so modifiziert wurde, dass er ein Neomycin-Resistenzgen (neoR; bezeichnet) exprimiert als pX330A-1×4neoRA). Um pX330A-1×4neoRA zu erhalten, wurde der 8962 bp große Vektor pX330A-1×4 innerhalb einer nicht-funktionellen Region durch Verdau mit PciI linearisiert, und neoR unter der Kontrolle des frühen Promotors des Affenvirus 40 (SV40) wurde als 1667 bp großes PciI eingefügt Fragment isoliert aus pX330-ΔNLS1/2neoR55. Im resultierenden Plasmid befand sich dieses Resistenzgen in paralleler Ausrichtung zu den sgRNA- und Cas9-Genen. Als nächstes wurden komplementäre DNA-Oligonukleotide, die die zielspezifischen Sequenzen der sgRNAs mit passenden 5'-Überhängen (Eurogentec; Ergänzungstabelle S7) enthielten, hybridisiert, phosphoryliert und in BpiI-verdautes und dephosphoryliertes pX330A-1×4neoRA kloniert. Die Genauigkeit der resultierenden Plasmide wurde durch Sequenzierung mit dem HU6-SF-Primer überprüft (Ergänzungstabelle S5). Die Plasmide pX330A-1×4neoRA-SLA-DMA gR2, -SLA-DMB gR3, -MHCIITA gR2 und -RFXAP gR2 wurden unter Verwendung des K2® Transfection System (Biontex) gemäß den Anweisungen des Herstellers in klonierte WSL-Zellen transfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen trypsinisiert, serienverdünnt und unter Verwendung von mit 0,5 mg/ml G418-Sulfat (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ergänzten Medien in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Resistente Einzelzellklone wurden weiter vermehrt und mittels Immunblot auf Cas9-Expression unter Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörpers überprüft (siehe unten). DNA von Cas9-positiven Zellen wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt und für die PCR und die anschließende Sequenzierung der PCR-Produkte verwendet, um die Integration der sgRNA-Sequenzen sowie Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden innerhalb zu bestätigen gezielte Gene. Die für PCR und Sequenzierung verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S5 aufgeführt.

Kodierungssequenzen von SLA-DMA (GenBank #NC_010449.5, nt 25133494 bis 25137928) und SLA-DMB (GenBank #NC_010449.5, nt 25119278 bis 25125089) wurden in silico gespleißt und codonoptimiert. Es wurde auch sichergestellt, dass die Bindungsregionen der ausgewählten sgRNA durch stille Basensubstitutionen so weit wie möglich verändert wurden (Ergänzende Abbildung S5). Die maßgeschneiderten Plasmide (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) pMA-SLA-DMA und -DMB enthielten 5'-EcoRI- und 3'-NotI-Restriktionsstellen zur bequemen Reklonierung der ORFs sowie eindeutige BpiI-Spaltstellen unmittelbar stromaufwärts der Terminationscodons , was die In-Frame-Insertion hybridisierter Oligonukleotide (Eurofins Genomics; Ergänzungstabelle S7), die für einen StepII-Tag (WSHPQFEK) bzw. einen Myc-Tag (LEQKLISEEDL) kodieren, in die BpiI- und NotI-verdauten Konstrukte ermöglichte. Korrekte Insertionen wurden durch Sequenzierung mit dem Primer M13 Rev (-24) verifiziert (Ergänzungstabelle S5). Die nativen und mit StrepII oder Myc markierten SLA-DMA-ORFs sowie die nativen und mit Myc markierten SLA-DMB-ORFs wurden als EcoRI/NotI-Fragmente in den entsprechend verdauten 8140-bp-Lentivirus-Vektor pLVX-IRES-Puro (TaKaRA/ Clontech). Als Kontrolle wurde auch der ORF eingefügt, der das verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP) kodiert, das als 772 bp EcoRI/NotI-Fragment von pEGFP-N1 (Clontech) isoliert wurde, was zu pLVX-EGFP-IRES-Puro führte. Korrekte Plasmidklone wurden durch Sequenzierung unter Verwendung des Primers CMV Promotor-F identifiziert (Ergänzungstabelle S5). Die Proteinexpression wurde in mit den neu generierten Plasmiden transfizierten RK13-Zellen (X-tremeGENE™ HP-Reagenz, Roche) und einer Immunoblot-Analyse unter Verwendung der Anti-Myc- und Anti-Strep-Antikörper bestätigt.

Lentiviren, die für das SLA-DMA-Strep-, SLA-DMA-Myc-, SLA-DMB-Myc- bzw. EGFP-Gen oder leeres pLVX-IRES-Puro kodieren, wurden in HEK-293-T-Zellen gemäß dem von Joung beschriebenen Protokoll erzeugt. et al.78 WSL-, WSL-SLA-DMAKO- (11) und WSL-SLA-DMBKO- (9) Zellklone wurden transduziert und Knockout/Knockin-Zellen (WSLKO/KI) wurden unter Verwendung von 1 µg/ml Puromycin selektiert. Das Ausschalten des nativen Gens und die Transgenintegration wurden durch PCR und Sequenzierung unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle S5 aufgeführten Primer bestätigt. Die Transgenexpression wurde erneut durch Immunblotting bestätigt, wie unten beschrieben.

Die generierten Plasmide und PCR-amplifizierten (KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase, Merck) relevanten Genomfragmente rekombinanter WSL-Zelllinien wurden mit den angegebenen Primern und dem BigDye™ Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) in einem sequenziert Genetischer Analysator Applied Biosystems 3500 (Thermo Fisher Scientific). Die Ergebnisse wurden mit dem Softwarepaket Geneious Prime 2021.0.1 (Biomatters, verfügbar unter https://www.geneious.com) ausgewertet.

Die Zellen wurden trypsinisiert, in Medium mit 10 % FCS resuspendiert, zentrifugiert und einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die sedimentierten Zellen wurden dann in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS) mit Probenpuffer (0,13 M Tris-HCl, pH 6,8; 4 % SDS; 20 % Glycerin; 0,01 % Bromphenolblau; 10 % 2-Mercaptoethanol) lysiert, beschallt und 5 Minuten bei 95 °C inkubiert. Die Proteine ​​wurden in diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Blots wurden 3 Stunden lang bei RT mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,25 % Tween 20 (TBS-T) blockiert und über Nacht mit spezifischen Primärantikörpern, verdünnt in 0,5 % Magermilch in TBS-T, sondiert. Bindung von monoklonalem Anti-FLAG (Klon M2, #F1804, Sigma-Aldrich), Anti-α-Tubulin (#T5168, Sigma-Aldrich) und polyklonalem Kaninchen-Anti-StrepII (#4217, ProSci), Anti-Myc (#PA1). -581, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), Anti-HLA-DMA (H00003108-D01P, Abnova) und Anti-HLA-DMB (H00003109-D01P, Abnova) Antikörper wurden mit sekundärem Fluorophor-markiertem Esel-Anti-Kaninchen-IRDye 800CW sichtbar gemacht (#926-32213, Li-Cor Biosciences) oder Esel-Anti-Maus-IRDye 680RD (#926-68072, Li-Cor Biosciences) Antikörper in TBS-T. Fluoreszenzsignale wurden mit einem Odyssey CLx-Infrarot-Bildgebungssystem (CLX-2293; Li-Cor Biosciences) erfasst.

WSL-, WSLKO- und WSLKO/KI-Zellen wurden mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Viren seriell in Zellkulturmedium, ergänzt mit 5 % FCS, verdünnt und auf die konfluenten Zellschichten aufgetragen. Die Zellen wurden 2 Stunden lang bei 37 °C und 2,5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurde das Inokulum entfernt und durch Methocel-Medium (6 g/L Methylcellulose in MEM mit 5 % FCS) ersetzt. Die PrV-Infektion wurde wie unten beschrieben durch die inhärente GFP-Expression von PrV-BaΔgGG drei Tage nach der Infektion sichtbar gemacht und dokumentiert. Vier Tage nach der ASFV-Infektion wurde das Medium entfernt und die Zellen einmal mit PBS gewaschen, bevor sie mit 4 % Paraformaldehyd in PBS (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) fixiert wurden. Die Formaldehydfixierung wurde durch Waschen und anschließende Inkubation mit 5 mM NH4Cl in PBS für 30 Minuten bei RT gestoppt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und bis zum Nachweis des ASFV-Antigens durch indirekte Immunfluoreszenztests (IF) bei 4 °C gelagert (siehe unten).

ASFV- und PrV-infizierte Zellen, Herde und Plaques wurden mit einem motorisierten Fluoreszenzmikroskop Leica DMi8 sichtbar gemacht. Mit der Leica Application Suite X-Software wurden ganze Wells abgebildet und die resultierenden Mosaikbilder zusammengeführt. Für jedes Virus und jede Zelllinie wurden die Flächen von 50 infizierten Zellen oder Plaques mit dem Freihand-Auswahltool von ImageJ (Version 1.53f51; http://imagej.nih.gov/ij) in drei unabhängigen Experimenten bestimmt. Die mittleren Plaquegrößen der jeweiligen auf WSL-Zellen gezüchteten Viren wurden auf 100 % gesetzt und die mittleren relativen Plaquegrößen der auf WSLKO- oder WSLKO/KI-Zellen gezüchteten Viren sowie Standardabweichungen wurden mit GraphPad Prism (Version 9) berechnet. Zur Bestimmung der Plattierungseffizienz wurden die Plaques gezählt und die scheinbaren Titer als PFU/ml berechnet.

WSL-, WSLKO- und WSLKO/KI-Zellen wurden in einer Dichte von 4 × 105 Zellen (für PrV-Infektion) oder 3 × 105 Zellen (für ASFV-Infektion) pro Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Einen Tag später wurden PrV-BaΔgGG, ASFV Armenia oder ASFV Kenya mit einer MOI von 0,02 angewendet. Nach einer Inkubation bei RT (PrV) oder 37 °C (ASFV) für 2 Stunden wurden die Zellen einmal mit Medium gewaschen und anschließend mit 1 ml Medium, das 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco) enthielt, überschichtet. PrV-infizierte Zellen wurden drei Tage nach der Infektion bei -80 °C eingefroren. Einzelne Platten mit ASFV-infizierten Zellen wurden unmittelbar nach der Zugabe des Mediums sowie alle 24 Stunden bis 168 Stunden pi eingefroren. Zur Titration wurden die Platten aufgetaut und die Lysate in Reaktionsgefäße überführt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 2655 xg und 4 °C wurden die Überstände in frische Röhrchen überführt und bei –80 °C gelagert. Virustitrationen wurden an konfluenten RK13-Zellen (PrV) oder WSL-Zellen (ASFV) in 96-Well-Platten durchgeführt. Nach der Inokulation mit Reihenverdünnungen der Virusüberstände (100 µl/Well) wurden die Zellen 2 Stunden lang bei RT auf einem Wippgerät (PrV) inkubiert oder vor dem Virusüberstand 1 Stunde lang bei 689 xg und 37 °C (ASFV) zentrifugiert wurde entfernt und die Zellen mit Methocel-Medium überschichtet. Die Zellen wurden 3 Tage (PrV) bzw. 4 Tage (ASFV) bei 37 °C in einer 2,5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. PrV-infizierte Zellen wurden 1 Stunde lang durch Zugabe einer 3,7 %igen Formaldehydlösung fixiert und anschließend mit 1 % Kristallviolett angefärbt, um die Plaques sichtbar zu machen. Mit ASFV infizierte Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, mit eiskaltem Aceton/Methanol (1:1, Vol./Vol.) 30 Minuten lang bei –20 °C fixiert und an der Luft getrocknet. Infizierte Zellen wurden durch IF-Färbung sichtbar gemacht.

Zur Analyse der viralen DNA-Replikation wurden WSL- und WSLKO-Zellen mit einer Dichte von 3 × 10 Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden später mit ASFV Armenia bei einer MOI von 3 in jeweils zwei Replikaten infiziert. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37 °C wurde das Inokulum entfernt und nach einem Waschen durch Medium ersetzt. Nach 0, 2, 4, 8, 16 und 32 h bei 37 °C wurde das Medium erneut abgesaugt und die Zellen einmal mit PBS gewaschen, pelletiert und bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert. Die DNA wurde mit dem NucleoMag Tissue Kit (Macherey-Nagel) gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt und in 100 µl Elutionspuffer eluiert.

Eine quantitative Echtzeit-PCR zum DNA-Nachweis wurde unter Verwendung des QuantiTect Multiplex PCR NoROX-Kits (Qiagen) in 12,5-µl-Reaktionen mit 2,5 µl infizierter Zell-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die ASFV B646L-Gen-spezifischen Primerpaare AKB646L-408F und AKB646L-507R sowie das β-Actin-Gen-spezifische Primerpaar ACT-CP-F und ACT-CP-R (Ergänzungstabelle S5) waren bei 800 nM enthalten. und die TaqMan-Sonden AKB646L-460P und ACT-CP-P (Ergänzungstabelle S5) bei Endkonzentrationen von 160 nM. Primer und Sonden wurden von Eurogentec bezogen. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 95 °C inkubiert, gefolgt von 45 Zyklen von 30 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 30 Sekunden bei 68 °C in einem Bio-Rad C1000/CFX96 Echtzeit-PCR-Gerät. Die Ergebnisse waren analysiert mit der CFX Maestro-Software (Bio-Rad). Die Kopienzahlen des ASFV-Genoms wurden auf der Grundlage von Standardkurven bestimmt, die durch Reaktionen mit 1010, 108, 106, 104, 102 oder 100 Kopien eines p72-Expressionsplasmids (pCAGGS-p72-Georgia, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von GM Keil) erstellt wurden.

Nach der Fixierung der Zellen mit PFA wie oben beschrieben wurden die Zellen optional mit 0,5 % Triton-X 100 in PBS für 15 Minuten bei RT permeabilisiert. Dieser Schritt war für die Visualisierung von Oberflächenproteinen oder nach der Fixierung mit Aceton/Methanol nicht erforderlich. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 10 % FCS in PBS für 1 Stunde bei RT, dem polyklonalen Kaninchen-Anti-ASFV-p72-Antikörper82 oder dem monoklonalen Maus-Anti-Schwein-MHC-II-Antikörper (Klon MSA 3) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Luise Hartmann) blockiert und Ulrike Blohm), verdünnt in Blockierungspuffer, wurden 1 Stunde lang bei RT angewendet und mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 488 (#A11008, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) oder Ziegen-Anti-Maus-Alexa-Fluor 488 (#A11001) nachgewiesen , Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) Sekundärantikörper verdünnt in PBS für eine weitere Stunde. Für den Nachweis des p72-Antigens in WSLKO/KI-Zellen wurde der sekundäre Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 647-Antikörper (#A21245; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) verwendet, um die Visualisierung auch in den GFP-exprimierenden Kontrollzelllinien zu ermöglichen. Nukleinsäuren wurden mit Hoechst 33342 (#H3570; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 15 Minuten lang bei RT gefärbt. Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und schließlich mit einem Leica DMi8-Fluoreszenzmikroskop analysiert.

Konfluente Monoschichten von WSL, WSL DMAKO (11), WSL DMBKO (9), WSL CIITAKO (1) und WSL RFXAPKO (6) (n = 3 pro Klon) wurden in 2 % SDS in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) lysiert ) für 10 Min. bei 95 °C. Die Lysate wurden durch Zentrifugation (14.000 × g, 10 min, RT) geklärt und die Überstände gesammelt. Aliquote mit 100 µg Protein (bestimmt durch BCA-Assay) wurden durch Zugabe von 3 Volumina eiskaltem Aceton ausgefällt. Proteinpellets wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g und 4 °C gewonnen und unter Verwendung des EasyPep™ Mini MS Sample Prep Kit (Thermo Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers in Peptide verdaut.

Die Peptide wurden in 0,1 % Ameisensäure (FA) resuspendiert und die Peptidausbeuten mittels BCA-Assay bestimmt. Peptide (1 µg/Probe) wurden auf einem nanoElute® (Bruker, Bremen, Deutschland) HPLC, ausgestattet mit einer IonOpticks Aurora-Säule (25 cm × 75 µm ID, 1,6 µm C18), bei einer Temperatur von 40 °C und einer Durchflussrate getrennt von 400 nL/min gekoppelt an ein timsTOF Pro-Gerät (Bruker). Lösungsmittel A war 0,1 % FA und Lösungsmittel B 0,1 % FA in Acetonitril. Peptide wurden mit einem Gradienten von 2 bis 15 % Lösungsmittel B (0–60 Min.), 15–24 % Lösungsmittel B (60–90 Min.), 24–34 % Lösungsmittel B (90–105 Min.), 34–95 eluiert % Lösungsmittel B (105–107 Min.). Das timsTOF Pro-Instrument war mit einer CaptiveSpray-Nano-Elektrospray-Ionenquelle (Bruker) ausgestattet und wurde im PASEF-Modus (Parallel Accumulation and Serial Fragmentation) unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Standard-DDA-Methode für die Proteomanalyse (1,1 s Zykluszeit) betrieben.

Rohe MS-Daten wurden mit Fragpipe83 unter Verwendung einer Datenbank mit Schweinesequenzen verarbeitet, die aus dem Ensembl-Repository84 heruntergeladen wurden. Die qualitative und quantitative Analyse der Proteinidentifizierungen wurde mit der Statistiksprache R85 und Perseus v1.6.15.086 durchgeführt. Das R-Paket gprofiler2 Version 0.2.187 wurde verwendet, um Schweineproteinidentifikatoren auf die entsprechenden Gene zu verweisen (HGNC-Nomenklatur).

WSL-, WSL-SLA-DMAKO- und WSL-CIITAKO-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1,5 × 106 Zellen/Well ausgesät. 24 Stunden später wurde eine vollständige Platte jedes Typs mit ASFV Armenia bei einer MOI von 5 infiziert. Das Virus konnte 2 Stunden lang bei 37 °C in die Zellen eindringen. Anschließend wurde die Virussuspension entfernt und durch frisches Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin ersetzt. 16 Stunden nach der Virusapplikation wurden die Zellen in das Medium gekratzt und in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellsuspension wurde 7 Minuten lang bei 350 × g und 4 ° C zentrifugiert. Die Zellen wurden einmal mit 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer (pH 7,2) gewaschen, bevor sie mit 2,5 % Glutaraldehyd in Cacodylat-Puffer (beide SERV-Elektrophorese) für mindestens 2 Stunden bei 4 °C fixiert wurden. Fixierte Zellen wurden erneut zentrifugiert (5 min, 1000 × g, 4 °C) und das Pellet in niedrig schmelzende Agarose (Sigma Aldrich) eingebettet. Nach dem Trocknen wurde die Agarose in kleine Stücke (1 mm3) geschnitten, in 1 % wässrigem OsO4 nachfixiert und in 2,5 % Uranylacetat gefärbt (beides SERVA-Elektrophorese). Nach einer schrittweisen Dehydratisierung in Ethanol wurden die Proben in Propylenoxid geklärt und mit Glycidether 100 (SERVA Electrophoresis) infiltriert. Zur Polymerisation wurden die Proben in Kapseln gefüllt und 3 Tage bei 60 °C inkubiert. Der interessierende Punkt wurde beschnitten und die vorbereiteten ultradünnen Schnitte wurden auf mit Formvar beschichtete Nickelgitter (Plano, Wetzlar, Deutschland) übertragen. Alle Gitter wurden vor der Untersuchung mit einem Tecnai Spirit-Transmissionselektronenmikroskop (FEI, Eindhoven, Niederlande) bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV mit Uranylacetat und Bleicitrat gegengefärbt.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism (Version 9.0) durchgeführt. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in der Beschichtungseffizienz wurde durch eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest berechnet. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in der Plaquegröße wurde durch den Kruskal-Wallis-Test und anschließend durch den Dunn-Mehrfachvergleichstest geschätzt. Die Anzahl der Wiederholungen der Messungen ist in jeder Abbildungslegende angegeben. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen und wird in den Abbildungen in Form von Sternchen (* < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001, **** < 0,0001) dargestellt.

Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD034242 beim ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt. Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlichen Daten sind in der Arbeit und/oder den ergänzenden Materialien enthalten.

Blome, S., Gabriel, C. & Beer, M. Pathogenese der Afrikanischen Schweinepest bei Hausschweinen und europäischen Wildschweinen. Virus Res. 173, 122–130. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.026 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gavier-Widen, D., Stahl, K. & Dixon, L. Keine voreiligen Lösungen für die Afrikanische Schweinepest. Wissenschaft 367, 622–624. https://doi.org/10.1126/science.aaz8590 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Dixon, LK, Stahl, K., Jori, F., Vial, L. & Pfeiffer, DU Epidemiologie und Bekämpfung der Afrikanischen Schweinepest. Annu. Rev. Anim. Biowissenschaften. 8, 221–246. https://doi.org/10.1146/annurev-animal-021419-083741 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Montgomery, R. Über eine Form der Schweinepest, die in Britisch-Ostafrika (Kolonie Kenia) auftritt. J. Comp. Pathol. Dort. 34, 159–191. https://doi.org/10.1016/s0368-1742(21)80031-4 (1921).

Artikel Google Scholar

Mulumba-Mfumu, LK et al. Afrikanische Schweinepest: Update zu Ost-, Zentral- und Südafrika. Grenzüberschreitend. Emerg. Dis. 66, 1462–1480. https://doi.org/10.1111/tbed.13187 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Bastos, AD et al. Genotypisierung von Feldstämmen des Virus der Afrikanischen Schweinepest durch teilweise Charakterisierung des p72-Gens. Bogen. Virol. 148, 693–706. https://doi.org/10.1007/s00705-002-0946-8 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galindo, I. & Alonso, C. Afrikanisches Schweinepestvirus: Ein Rückblick. Viren https://doi.org/10.3390/v9050103 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilkinson, PJ in Virus Infections of Swine (Hrsg. MC Pensaert) 17–32 (Elesevier, 1989).

Rowlands, RJ et al. Isolat des Virus der Afrikanischen Schweinepest, Georgia, 2007. Emerg. Infizieren. Dis. 14, 1870–1874. https://doi.org/10.3201/eid1412.080591 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koonin, EV & Yutin, N. Ursprung und Entwicklung eukaryotischer großer nukleozytoplasmatischer DNA-Viren. Intervirologie 53, 284–292. https://doi.org/10.1159/000312913 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yutin, N. & Koonin, EV Verborgene evolutionäre Komplexität nukleozytoplasmatischer großer DNA-Viren von Eukaryoten. Virol J. 9, 161. https://doi.org/10.1186/1743-422X-9-161 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alonso, C. et al. Taxonomieprofil des ICTV-Virus: Asfarviridae. J. General Virol. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001049 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

(ICTV), IC o. Zu. V. ICTV Master Species List 2019.v1, (2020).

Chapman, DA, Tcherepanov, V., Upton, C. & Dixon, LK Vergleich der Genomsequenzen von nicht pathogenen und pathogenen Afrikanischen Schweinepest-Virus-Isolaten. J. General Virol. 89, 397–408. https://doi.org/10.1099/vir.0.83343-0 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Villiers, EP et al. Phylogenomische Analyse von 11 vollständigen Genomsequenzen des Virus der Afrikanischen Schweinepest. Virology 400, 128–136 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Yanez, RJ et al. Analyse der vollständigen Nukleotidsequenz des Virus der Afrikanischen Schweinepest. Virology 208, 249–278 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wöhnke, E. et al. Vergleich der Proteome von Schweinemakrophagen und einer stabilen Schweinezelllinie nach Infektion mit dem Virus der Afrikanischen Schweinepest. Viren 13, 2198 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, N. et al. Architektur des Virus der Afrikanischen Schweinepest und Auswirkungen auf die Virusassemblierung. Wissenschaft 366, 640–644. https://doi.org/10.1126/science.aaz1439 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Alejo, A., Matamoros, T., Guerra, M. & Andres, G. Ein proteomischer Atlas des Viruspartikels der Afrikanischen Schweinepest. J. Virol. https://doi.org/10.1128/JVI.01293-18 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Keßler, C. et al. Das intrazelluläre Proteom des Afrikanischen Schweinepestvirus. Wissenschaft. Rep. 8, 14714. https://doi.org/10.1038/s41598-018-32985-z (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dixon, LK, Chapman, DA, Netherton, CL & Upton, C. Replikation und Genomik des Afrikanischen Schweinepestvirus. Virus Res. 173, 3–14. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.020 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Andres, G., Charro, D., Matamoros, T., Dillard, RS & Abrescia, NGA Die Kryo-EM-Struktur des Virus der Afrikanischen Schweinepest enthüllt eine einzigartige Architektur, die aus zwei ikosaedrischen Proteinkapsiden und zwei Lipoproteinmembranen besteht. J. Biol. Chem. 295, 1–12. https://doi.org/10.1074/jbc.AC119.011196 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, S. et al. Kryo-EM-Struktur des Afrikanischen Schweinepestvirus. Zellwirtsmikrobe 26, 836-843.e833. https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.11.004 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galindo, I. et al. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest infiziert Makrophagen, die natürlichen Wirtszellen, über Clathrin- und Cholesterin-abhängige Endozytose. Virus Res. 200, 45–55. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2015.01.022 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hernaez, B. & Alonso, C. Dynamin- und Clathrin-abhängige Endozytose beim Eintritt des Virus der Afrikanischen Schweinepest. J. Virol. 84, 2100–2109. https://doi.org/10.1128/JVI.01557-09 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hernaez, B., Guerra, M., Salas, ML & Andres, G. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest erfährt eine Zerstörung der äußeren Hülle, Zerlegung des Kapsids und Fusion der inneren Hülle, bevor der Kern aus multivesikulären Endosomen freigesetzt wird. PLoS Pathog. 12, e1005595. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005595 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanchez, EG et al. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest nutzt Makropinozytose, um in Wirtszellen einzudringen. PLoS Pathog. 8, e1002754. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002754 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cuesta-Geijo, MA et al. Endosomale Reifung, Rab7-GTPase und Phosphoinositide beim Eintritt des Virus der Afrikanischen Schweinepest. PLoS ONE 7, e48853. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0048853 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Netherton, CL & Wileman, TE Organellenumlagerungen des Virus der Afrikanischen Schweinepest. Virus Res. 173, 76–86. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.12.014 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Andrés, G., García-Escudero, R., Simón-Mateo, C. & Viñuela, E. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest ist von einer zweimembranigen, kollabierten Zisterne umgeben, die aus dem endoplasmatischen Retikulum stammt. J. Virol. 72, 8988–9001. https://doi.org/10.1128/jvi.72.11.8988-9001.1998 (1998).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rouiller, I., Brookes, SM, Hyatt, AD, Windsor, M. & Wileman, T. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest wird vom endoplasmatischen Retikulum umhüllt. J. Virol. 72, 2373–2387. https://doi.org/10.1128/jvi.72.3.2373-2387.1998 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salas, ML & Andres, G. Morphogenese des Virus der Afrikanischen Schweinepest. Virus Res. 173, 29–41. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.09.016 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suarez, C. et al. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest baut eine einzelne Membran auf, die durch einen Bruch des endoplasmatischen Retikulums entsteht. Zelle. Mikrobiol. https://doi.org/10.1111/cmi.12468 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Breese, SS Jr. & Pan, IC Elektronenmikroskopische Beobachtung der Entwicklung des Virus der Afrikanischen Schweinepest in Vero-Zellen. J. General Virol. 40, 499–502 (1978).

Artikel PubMed Google Scholar

Jouvenet, N., Monaghan, P., Way, M. & Wileman, T. Der Transport des Virus der Afrikanischen Schweinepest von den Sammelstellen zur Plasmamembran hängt von Mikrotubuli und herkömmlichem Kinesin ab. J. Virol. 78, 7990–8001. https://doi.org/10.1128/JVI.78.15.7990-8001.2004 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jouvenet, N. et al. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest induziert filopodienartige Vorsprünge an der Plasmamembran. Zelle. Mikrobiol. 8, 1803–1811. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2006.00750.x (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Alcami, A., Carrascosa, AL & Vinuela, E. Der Eintritt des Virus der Afrikanischen Schweinepest in Vero-Zellen. Virology 171, 68–75 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Valdeira, ML, Bernardes, C., Cruz, B. & Geraldes, A. Eintritt des Virus der Afrikanischen Schweinepest in Vero-Zellen und Entfernung der Beschichtung. Tierarzt. Mikrobiol. 60, 131–140. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(98)00152-7 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bernardes, C., Antonio, A., Pedroso de Lima, MC & Valdeira, ML Cholesterin beeinflusst die Infektion mit dem Virus der Afrikanischen Schweinepest. Biochim. Biophys. Verfahren 1393, 19–25. https://doi.org/10.1016/s0005-2760(98)00051-4 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miguel Angel, CG et al. Der Cholesterinfluss ist für das endosomale Fortschreiten der Afrikanischen Schweinepest-Virionen während der anfänglichen Etablierung der Infektion erforderlich. J. Virol. https://doi.org/10.1128/JVI.02694-15 (2015).

Artikel Google Scholar

Cuesta-Geijo, MA, Barrado-Gil, L., Galindo, I., Munoz-Moreno, R. & Alonso, C. Umverteilung endosomaler Membranen zur Replikationsstelle des Virus der Afrikanischen Schweinepest. Viren https://doi.org/10.3390/v9060133 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cuesta-Geijo, M. Á. et al. Neue Erkenntnisse über die Rolle endosomaler Proteine ​​bei der Infektion mit dem Virus der Afrikanischen Schweinepest. PLoS Pathog. 18, e1009784. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009784 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Puschnik, AS, Majzoub, K., Ooi, YS & Carette, JE Eine CRISPR-Toolbox zur Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen. Nat. Rev. Microbiol. 15, 351–364. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.29 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, C. et al. Das CRISPR-Screening der Schweine-sgRNA-Bibliothek identifiziert Wirtsfaktoren, die mit der Replikation des japanischen Enzephalitis-Virus verbunden sind. Nat. Komm. 11, 5178. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18936-1 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, J. et al. Genomweites CRISPR/Cas9-Screening identifiziert Wirtsfaktoren, die für die Replikation des Influenzavirus wesentlich sind. Cell Rep. 23, 596–607. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.03.045 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karakus, U. et al. MHC-Klasse-II-Proteine ​​vermitteln den artenübergreifenden Eintritt von Fledermaus-Influenzaviren. Natur 567, 109–112. https://doi.org/10.1038/s41586-019-0955-3 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Marceau, CD et al. Genetische Dissektion von Flaviviridae-Wirtsfaktoren durch CRISPR-Screenings im Genommaßstab. Natur 535, 159–163. https://doi.org/10.1038/nature18631 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Orchard, RC et al. Identifizierung von Antinorovirus-Genen in menschlichen Zellen mithilfe eines genomweiten CRISPR-Aktivierungsscreenings. J. Virol. 93, e01324-e11318. https://doi.org/10.1128/JVI.01324-18 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Park, RJ et al. Ein genomweites CRISPR-Screening identifiziert eine begrenzte Anzahl von HIV-Wirtsabhängigkeitsfaktoren. Nat. Genet. 49, 193–203. https://doi.org/10.1038/ng.3741 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ren, Q. et al. Ein Dual-Reporter-System für Echtzeitüberwachung und Hochdurchsatz-CRISPR/Cas9-Bibliotheksscreening des Hepatitis-C-Virus. Wissenschaft. Rep. 5, 8865. https://doi.org/10.1038/srep08865 (2015).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thamamongood, T. et al. Ein genomweites CRISPR-Cas9-Screening zeigt, dass für eine Schmallenberg-Virus-Infektion eine Sulfatierung der Wirtszellen erforderlich ist. J. Virol. 94, e00752-00720. https://doi.org/10.1128/JVI.00752-20 (2020).

Artikel Google Scholar

Hölper, JE et al. Ein genomweites CRISPR/Cas9-Screening zeigt, dass die Sphingomyelin-Synthase 1 des Wirts für eine Infektion mit der Pseudorabiesvirus-Mutante gD(−)Pass erforderlich ist. Viren https://doi.org/10.3390/v13081574 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Portugal, R., Martins, C. & Keil, GM Neuartiger Ansatz zur Erzeugung des rekombinanten Afrikanischen Schweinepestvirus aus einem Feldisolat unter Verwendung von GFP-Expression und 5-Brom-2′-desoxyuridin-Selektion. J. Virol. Methoden 183, 86–89. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2012.03.030 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sanchez, EG et al. Phänotypisierung und Anfälligkeit etablierter Schweinezelllinien für eine Infektion mit dem Afrikanischen Schweinepestvirus und Virusproduktion. Wissenschaft. Rep. 7, 10369. https://doi.org/10.1038/s41598-017-09948-x (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hübner, A. et al. Effiziente Hemmung der Replikation des Virus der Afrikanischen Schweinepest durch CRISPR/Cas9-Targeting des viralen p30-Gens (CP204L). Wissenschaft. Rep. 8, 1449. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19626-1 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hemmink, JD et al. Die Löschung des CD2v-Gens aus dem Genom von ASFV-Kenya-IX-1033 reduziert teilweise die Virulenz und induziert Schutz bei Schweinen. Viren https://doi.org/10.3390/v14091917 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, W. et al. MAGeCK ermöglicht eine zuverlässige Identifizierung essentieller Gene aus CRISPR/Cas9-Knockout-Screens im Genommaßstab. Genombiol. 15, 554. https://doi.org/10.1186/s13059-014-0554-4 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reith, W., LeibundGut-Landmann, S. & Waldburger, JM Regulierung der MHC-Klasse-II-Genexpression durch den Klasse-II-Transaktivator. Nat. Rev. Immunol. 5, 793–806. https://doi.org/10.1038/nri1708 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smith, DM et al. Nomenklatur für Faktoren des Schweine-Leukozyten-Antigen-Klasse-II-Systems, 2005. Tissue Antigens 66, 623–639. https://doi.org/10.1111/j.1399-0039.2005.00492.x (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blum, JS, Wearsch, PA & Cresswell, P. Wege der Antigenverarbeitung. Annu. Rev. Immunol. 31, 443–473. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032712-095910 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Durand, B. et al. RFXAP, eine neue Untereinheit des RFX-DNA-Bindungskomplexes, ist bei MHC-Klasse-II-Mangel mutiert. EMBO J. 16, 1045–1055. https://doi.org/10.1093/emboj/16.5.1045 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Masternak, K. et al. Ein Gen, das für einen neuen RFX-assoziierten Transaktivator kodiert, ist bei der Mehrzahl der Patienten mit MHC-Klasse-II-Mangel mutiert. Nat. Genet. 20, 273–277. https://doi.org/10.1038/3081 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagarajan, UM et al. RFX-B ist das Gen, das für die häufigste Ursache des Bare-Lymphozyten-Syndroms, einer MHC-Klasse-II-Immunschwäche, verantwortlich ist. Immunität 10, 153–162. https://doi.org/10.1016/s1074-7613(00)80016-3 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Steimle, V. et al. Ein neuartiger DNA-bindender regulatorischer Faktor ist beim primären MHC-Klasse-II-Mangel (Bare-Lymphozyten-Syndrom) mutiert. Genes Dev. 9, 1021–1032. https://doi.org/10.1101/gad.9.9.1021 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Steimle, V., Otten, LA, Zufferey, M. & Mach, B. Komplementationsklonierung eines MHC-Klasse-II-Transaktivators, der bei erblichem MHC-Klasse-II-Mangel (oder Bare-Lymphozyten-Syndrom) mutiert ist. Zelle 75, 135–146 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lithgow, P., Takamatsu, H., Werling, D., Dixon, L. & Chapman, D. Korrelation der Expression von Zelloberflächenmarkern mit einer Infektion mit dem Virus der Afrikanischen Schweinepest. Tierarzt. Mikrobiol. 168, 413–419. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2013.12.001 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, JJ et al. Mechanismen der Pathogenese des Afrikanischen Schweinepestvirus und der Immunumgehung, abgeleitet aus Genexpressionsänderungen in infizierten Schweinemakrophagen. PLoS ONE 14, e0223955. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223955 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tomazin, R. et al. Das Zytomegalievirus US2 zerstört zwei Komponenten des MHC-Klasse-II-Signalwegs und verhindert so die Erkennung durch CD4+-T-Zellen. Nat. Med. 5, 1039–1043. https://doi.org/10.1038/12478 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Reith, W. & Mach, B. Das Bare-Lymphozyten-Syndrom und die Regulierung der MHC-Expression. Annu. Rev. Immunol. 19, 331–373. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.19.1.331 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chamorro, S. et al. Phänotypische Charakterisierung von Monozyten-Subpopulationen beim Schwein. Immunbiologie 202, 82–93. https://doi.org/10.1016/s0171-2985(00)80055-8 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Summerfield, A. et al. Dendritische Zellen des peripheren Bluts von Schweinen und natürliche Interferon-produzierende Zellen. Immunologie 110, 440–449. https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2003.01755.x (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilson, AD et al. Expression von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-II-Antigenen auf normalem Schweinedarmendothel. Immunologie 88, 98–103. https://doi.org/10.1046/j.1365-2567.1996.d01-640.x (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Enjuanes, L., Cubero, I. & Viñuela, E. Empfindlichkeit von Makrophagen verschiedener Arten gegenüber dem Virus der Afrikanischen Schweinepest (ASF). J. General Virol. 34, 455–463. https://doi.org/10.1099/0022-1317-34-3-455 (1977).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gomez-Villamandos, JC, Bautista, MJ, Sanchez-Cordon, PJ & Carrasco, L. Pathologie der Afrikanischen Schweinepest: Die Rolle von Monozyten-Makrophagen. Virus Res. 173, 140–149. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2013.01.017 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hemmink, JD et al. Das Afrikanische Schweinepest-Isolat ASFV-Kenya-IX-1033 ist nach Vermehrung in der Wildschweinzelllinie WSL hochvirulent und stabil. Viren https://doi.org/10.3390/v14091912 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Klingbeil, K., Lange, E., Teifke, JP, Mettenleiter, TC & Fuchs, W. Immunisierung von Schweinen mit einer abgeschwächten Pseudorabiesvirus-Rekombinante, die das Hämagglutinin des pandemischen Schweine-Influenza-A-Virus H1N1 exprimiert. J. General Virol. 95, 948–959. https://doi.org/10.1099/vir.0.059253-0 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Groenen, MA et al. Analysen von Schweinegenomen geben Einblicke in die Demographie und Evolution von Schweinen. Natur 491, 393–398. https://doi.org/10.1038/nature11622 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Joung, J. et al. CRISPR-Cas9-Knockout- und Transkriptionsaktivierungs-Screening im Genommaßstab. Nat. Protokoll. 12, 828–863. https://doi.org/10.1038/nprot.2017.016 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afgan, E. et al. Die Galaxy-Plattform für zugängliche, reproduzierbare und kollaborative biomedizinische Analysen: Update 2016. Nukleinsäuren Res. 44, W3–W10. https://doi.org/10.1093/nar/gkw343 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, M. Cutadapt entfernt Adaptersequenzen aus Sequenzierungslesevorgängen mit hohem Durchsatz. EMBnet. J. 17(3), 2011. https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200 (2011).

Artikel Google Scholar

Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K. & Yamamoto, T. Multiplex-Genom-Engineering in menschlichen Zellen unter Verwendung des All-in-one-CRISPR/Cas9-Vektorsystems. Wissenschaft. Rep. 4, 5400. https://doi.org/10.1038/srep05400 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hübner, A. et al. Identifizierung und Charakterisierung der Proteine ​​285L und K145R des Virus der Afrikanischen Schweinepest. J. General Virol. 100, 1303–1314. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001306 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yu, F. et al. Schnelle quantitative Analyse von timsTOF PASEF-Daten mit MSFragger und IonQuant. Mol. Zelle. Proteomics 19, 1575–1585. https://doi.org/10.1074/mcp.TIR120.002048 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aken, BL et al. Ensemble 2017. Nucl. Säuren Res. 45, D635–D642. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1104 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

R: Eine Sprache und Umgebung für statistisches Rechnen (R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich, 2020).

Tyanova, S. et al. Die Perseus-Rechenplattform für die umfassende Analyse von (Prote-)Omics-Daten. Nat Methods 13, 731–740. https://doi.org/10.1038/nmeth.3901 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Paket 'gprofiler2' v. 0.2.1 (2021).

Referenzen herunterladen

Die technische Hilfe von Christin Milde, Petra Meyer, Mandy Jörn, Patrick Zitzow und Anja Landmesser wird sehr geschätzt. Die verwendeten ASFV-Isolate und -Mutanten wurden freundlicherweise von Sandra Blome, Richard Bishop und Günther M. Keil zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus danken wir Matthias Lenk und Sylvia Kohler für die Lagerung und Kultivierung von WSL-Zellen, Florian Pfaff für die Hilfe bei der Sanger-Sequenzierung, Luise Hartmann und Ulrike Blohm für die Bereitstellung des SLA-DR-spezifischen Antikörpers sowie Thiprampai Thamamongood und Martin Schwemmle für wertvolle Hinweise zur Etablierung und Auswertung des CRISPR/Cas9-Screenings. Diese Arbeit wurde durch ein intramurales Stipendium des FLI unterstützt.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Jolene Carlson

Aktuelle Adresse: Ceva Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Deutschland

Institut für Molekulare Virologie und Zellbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493, Greifswald-Insel Riems, Deutschland

Katrin Pannhorst, Jolene Carlson, Julia E. Hölper, Elisabeth Wöhnke, Axel Karger & Walter Fuchs

Das Roslin Institute, University of Edinburgh, Midlothian, Großbritannien

Finn Gray und John Kenneth Baillie

Institut für Diagnostische Virologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Deutschland

Dirk Höper

Institut für Infektologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Deutschland

Kati Franzke

Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Germany

Thomas C. Mettenleiter

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung der Idee: WF und TCM; Methodik: KP, JEH, DH, JC und WF; Untersuchung: KP, JEH, JC, DH, EW und KF; formale Analyse: KP, DH, EW und KF; Validierung: KP, WF und TCM; Ressourcen: FG, JKB, JEH, AK und WF; Visualisierung: KP, EW und KF; Datenkuration: KP und AK; Schreiben-Originalentwurf: KP, WF, TCM mit Unterstützung von EW und KF; Alle Autoren stimmten zu und trugen zum endgültigen Entwurf des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Katrin Pannhorst.

KP, WF, FG und JKB sind Erfinder einer anhängigen Patentanmeldung im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Die anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Pannhorst, K., Carlson, J., Hölper, JE et al. Das nichtklassische Haupthistokompatibilitätskomplex-II-Protein SLA-DM ist für die Replikation des Virus der Afrikanischen Schweinepest von entscheidender Bedeutung. Sci Rep 13, 10342 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36788-9

Zitat herunterladen

Eingegangen: 08. Dezember 2022

Angenommen: 09. Juni 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36788-9

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.