Die Geometrie und Dynamik der 3D-Zellsegregation wird durch die Regulierung der Gewebeoberflächenspannung gesteuert

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 817 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Gewebemorphogenese und -musterung während der Entwicklung beinhaltet die Trennung von Zelltypen. Die Segregation wird durch unterschiedliche Gewebeoberflächenspannungen vorangetrieben, die von den Zelltypen erzeugt werden, indem die Bildung von Zell-Zell-Kontakten durch die Regulierung der Adhäsion und der auf Actomyosin-Kontraktilität basierenden zellulären kortikalen Spannungen kontrolliert wird. Wir verwenden Zelltypen von Wirbeltiergewebe und Vorläufer der Keimschicht von Zebrafischen als In-vitro-Modelle der dreidimensionalen heterotypischen Segregation und entwickelten eine quantitative Analyse ihrer Dynamik auf der Grundlage von 3D-Zeitraffermikroskopie. Wir zeigen, dass die allgemeine Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität durch den Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 die Segregation verzögert. Die zelltypspezifische Hemmung der nicht-muskulären Myosin2-Aktivität durch Überexpression des Myosin-Assemblierungsinhibitors S100A4 verringert die Oberflächenspannung des Gewebes, was sich in einer verringerten Verdichtung während der Aggregation und einer invertierten Geometrie während der Segregation äußert. Dasselbe wird beobachtet, wenn wir eine konstitutiv aktive Rho-Kinase-Isoform exprimieren, um die Kontraktilität von Actomyosin an Zell-Zell- und Zell-Medium-Grenzflächen allgegenwärtig hoch zu halten und so die grenzflächenspezifische Regulierung kortikaler Spannungen außer Kraft zu setzen. Die Regulierung der Gewebeoberflächenspannung kann ein wirksames Instrument im Tissue Engineering sein.

Die Selbstorganisation des Gewebes, beispielsweise die Trennung von Zelltypen auf der Grundlage ihrer biomechanischen Eigenschaften, ist ein wichtiger Bestandteil der Embryonalentwicklung bei Metazoen1,2,3. Zu den gut charakterisierten Beispielen zählen die Entwicklung der Gliedmaßenknospen von Küken4,5, die Blastozystenbildung bei Mäusen6,7,8 sowie die Gastrulation und die Keimblattbildung bei Zebrafisch- und Xenopus-Embryonen9,10,11,12. Auch die aufstrebenden Bereiche Tissue Engineering und Biofabrikation13 können die (unentdeckten) Mechanismen der Selbstorganisation nutzen.

Auf einer langen Zeitskala verhalten sich Gewebe wie viskose Flüssigkeiten, die durch eine spezifische Gewebeoberflächenspannung (TST) gekennzeichnet sind, als Ausdruck der Kohäsion, die durch Zelladhäsion und zelluläre kortikale Spannung bestimmt wird. Die relativen Beiträge von Adhäsion und kortikaler Spannung zur TST werden durch zwei Hypothesen untersucht: die Differentialadhäsionshypothese (DAH)4,14,15 und die Differentialinterfacial-Tension-Hypothese (DITH)16. Spezifische Unterschiede im TST gelten als Hauptursache für die Zellsegregation/-sortierung in vitro und in vivo und die Gewebeschichtung in der Entwicklung, obwohl andere Mechanismen wie kollektive Zellmigration17,18 und Polarisation10 oder Osmolarität19 eindeutig eine entscheidende Rolle spielen.

Im Verlauf der In-vitro-Segregation verschiedener Zelltypen tendiert der Zelltyp, der durch einen höheren TST gekennzeichnet ist, dazu, sich innerhalb von Zellen mit einem niedrigeren TST4,12,14,20,21,22 zu separieren, sie einzuhüllen oder von ihnen verschlungen zu werden. Um eine hohe TST zu erzeugen, muss die Zell-Medium-Grenzflächenspannung, die nur aus der Zellkortikalisspannung besteht, erhöht werden, während die Zell-Zell-Grenzflächenspannung verringert werden muss, da die TST vom Verhältnis der Zell-Medium-Grenzfläche zur Zell-Zell-Grenzfläche abhängt. Zellgrenzflächenspannungen. Die Zell-Zell-Grenzflächenspannung besteht hauptsächlich aus kortikaler Spannung, die durch die Actomyosin-Kontraktion erzeugt wird, während der (negative) Beitrag der Adhäsionsspannung gering ist; Daher erfordert die Reduzierung der Zell-Zell-Grenzflächenspannung eine aktive Reduzierung der lokalen kortikalen Spannung23.

An Zell-Zell-Grenzflächen wurde eine Erschöpfung von Nicht-Muskel-Myosin 2 (NM2) beobachtet, die mit einer offensichtlichen NM2- und Aktinakkumulation an der Zell-Medium-Grenzfläche in Keimschicht-Vorläuferzellen in vitro und in vivo einherging21,23. Es wurde gezeigt, dass kortikale mechanische Spannung die kortikale NM2-Lokalisierung in Drosophila-Embryonen fördert, wobei NM2 selbst in diesem Rekrutierungsprozess als Mechanosensor fungiert24,25. Die schnittstellenspezifische unterschiedliche Regulierung der kortikalen Spannung ist eine entscheidende Komponente der TST-Erzeugung und wird vermutlich durch Signale von den Zell-Zell-Adhäsionskomplexen zum Zytoskelett gesteuert26. Dieser Signalweg geht von Cadherin-Adhäsionsmolekülen aus, die mit Cadherinen einer anderen Kontaktzelle trans-gebunden werden und intrazelluläre Catenine rekrutieren, um einen Komplex zu bilden. Hier wird unter anderem p120-Catenin (Catenin-Delta1) rekrutiert und aktiviert, wodurch es RhoA hemmt, was zur Inaktivierung der Rho-Kinase und einer weiteren nachgelagerten Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität führt27,28,29,30,31.

Alle Komponenten des Zytoskeletts tragen zu den biomechanischen Eigenschaften der Zellen bei, das Aktomyosin-Zytoskelett ist jedoch von herausragender Bedeutung. Während das kortikale Aktinnetzwerk für die Erzeugung kortikaler Spannung unverzichtbar ist32, sind die Hauptakteure in diesem Prozess die Myosin-Motorproteine. Die in verschiedenen experimentellen Systemen aufgedeckten molekularen Wechselwirkungen unterstreichen die Bedeutung der lokalen Regulierung der Myosinaktivität für die Entwicklung biomechanischer Eigenschaften, die für die Selbstorganisation des Gewebes erforderlich sind.

Motiviert durch frühere Studien zur Rolle des Actomyosin-Zytoskeletts bei der Regulierung der Gewebeoberflächenspannung und -segregation21,23 haben wir diese Studien auf ein breiteres Spektrum von Wirbeltierzelltypen ausgeweitet und eine quantitative Analyse der Dynamik der Segregation entwickelt.

In diesem Artikel verwenden wir verschiedene Zelltypen von Wirbeltiergewebe und Vorläuferzellen der Keimschicht von Zebrafischen als In-vitro-Modelle der dreidimensionalen heterotypischen Segregation, um zu untersuchen, wie Störungen des kontraktilen Actomyosin-Systems die Erzeugung der Gewebeoberflächenspannung, die Dynamik der Aggregation und Segregation sowie beeinflussen die Geometrie getrennter homotypischer Domänen. Wir zeigen, dass die allgemeine pharmakologische Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität durch den Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitor Y27632 die Segregation aller getesteten Zelltypen verlangsamt, ohne die grundlegende räumliche Konfiguration der segregierten Domänen zu beeinflussen. Wir zeigen auch, dass die zelltypspezifische Hemmung der Nicht-Muskel-Myosin-2-Aktivität durch Überexpression des Myosin-Assemblierungsinhibitor-S100A4-Proteins die Gewebeoberflächenspannung verringert, was sich in fehlerhafter Aggregation und umgekehrter Segregationspositionierung äußert. Indem wir konstitutiv aktives ROCK in Zebrafisch-Ektodermzellen exprimieren, um die Kontraktilität von Actomyosin sowohl an Zell-Zell- als auch an Zell-Medium-Grenzflächen ständig zu aktivieren, zeigen wir, dass die Übersteuerung der grenzflächenspezifischen Regulierung der kortikalen Spannung und damit die Verhinderung einer lokalen Reduzierung der Zell-Zell-Grenzflächenspannung dazu führt fehlerhafte Kontaktbildung. Darüber hinaus führt ein solches Überschreiben zu einer verringerten Gewebeoberflächenspannung, die sich in einer verringerten Verdichtung und einer umgekehrten Segregationskonfiguration äußert, was die Rolle von ROCK bei der grenzflächenspezifischen Herunterregulierung der kortikalen Spannung für eine effektive Zellkontaktbildung unterstreicht.

Die Bildung von Zellkontakten ist der grundlegende Prozess, der der multizellulären Aggregation und Segregation zugrunde liegt. Um die Bildung und Adhäsion homotypischer Kontakte zu charakterisieren, verwendeten wir den DPA-Test (Dual Pipette Aspiration), um die Stärke der mechanischen Kopplung in kontaktbildenden Zellen zu messen. Wir haben homotypische Zelldubletts, die in Zellsuspensionen von zwei Modellzelltypen gebildet wurden, mechanisch getrennt: primäre Goldfisch-Keratinozyten (PFK) oder EPC-Fisch-Keratinozyten-Zelllinie, und die entsprechenden Trennkräfte gemessen. Die Bildung homotypischer Dubletts war auf eine Kontaktzeit von 1 Minute begrenzt und anschließend wurde eine schnelle Zelltrennung (t < 1 s) erreicht, so dass nur wenig Zeit für die Neuorganisation des Zell-Zell-Kontakts blieb. Daher lässt sich die Messung am besten als Trennung zweier elastischer Feststoffe beschreiben. Wir fanden heraus, dass homotypische Dubletts von PFK-Zellen durch eine viel höhere Kontaktstärke gekennzeichnet sind, die sich in höheren Trennkräften (Fs) äußert als EPC-Dubletts (Abb. 1a). Die Kontaktformen waren ebenfalls unterschiedlich, da beobachtet wurde, dass PFK-Dubletts größere Kontaktwinkel (45,1°, SEM = 0,71) als EPC-Dubletts (35,5°, SEM = 0,65) aufwiesen, was mit den Unterschieden in der Kontaktstärke übereinstimmt (Abb. 1b, c, Ergänzungsfilme 1 und 2).

a Trennkräfte Fs von Dubletts primärer Goldfisch-Keratinozyten (PFK) (n = 13) und EPC-Keratinozyten-Dubletts (n = 17), gemessen nach 1 Minute Kontaktbildung, mittlere Werte sind durch blaue und gelbe Linien hervorgehoben, Sternchen (*) zeigt statistisch signifikant an Unterschied zum Student-t-Test, p < 0,05. b, c Repräsentative Bilder von PFK-Dubletts (b) oder EPC-Dubletts (c), die während der Kontaktbildung mit einer Pipette gehalten wurden. Beachten Sie den Unterschied in den Kontaktwinkeln, der durch blaue oder gelbe Linien als Orientierung für das Auge hervorgehoben wird. Maßstabsleiste: 20 µm.

Die Trennung (oder Sortierung) zweier Zelltypen und die Bildung 3D-homotypischer Zelldomänen aus einer gleichmäßigen Mischung von ungefähr der gleichen Anzahl von Zellen ist ein selbstorganisierter Prozess, der hauptsächlich durch die Kontaktbildung und den Zusammenhalt der Zellen und die daraus resultierende Charakterisierung der Gewebeoberflächenspannung gesteuert wird die angegebenen Zelltypen. Um den grundlegenden Prozess der Segregation und die endgültige räumliche Positionierung der getrennten Domänen zu beobachten, haben wir drei Zelltyppaare ausgewählt, hauptsächlich auf der Grundlage früherer Daten zu ihren homotypischen Adhäsionskontaktstärken. Zunächst wurden primäre Goldfisch-Keratinozyten (PFK) und EPC-Fisch-Keratinozyten, die durch deutlich unterschiedliche homotypische Kontaktstärken gekennzeichnet sind (Abb. 1a), in Suspensionen in nicht anhaftenden Aggregationskammervertiefungen gemischt, in denen nur Zell-Zell-Adhäsion und keine Zell-Substrat-Adhäsion auftritt . Nach dem Mischen beobachteten wir den Prozess der Segregation durch Zeitraffer-Fluoreszenzvideomikroskopie und zeichneten die Bildserien einzelner Aggregate (n > 30) mehrere Stunden lang auf, bis die endgültigen räumlichen Konfigurationen der getrennten Domänen erreicht waren. In allen Experimenten wurden PFK-Zellen innerhalb des entstehenden Sphäroidaggregats getrennt, während EPC-Zellen die äußere Domäne bildeten (Abb. 2a, Zusatzfilm 3). Als nächstes testeten wir A431-Human-Epithelkarzinomzellen und HT1080-Human-Fibrosarkomzellen in Mischungen und beobachteten deren Aufteilung in Aggregate (n > 20), bis die endgültigen räumlichen Konfigurationen homotypischer Domänen erreicht wurden. Die Segregationsdynamik war langsamer als bei PFK + EPC-Fischkeratinozyten beobachtet, dennoch waren A431-Epithelzellen immer im Inneren getrennt und HT1080-Zellen bildeten die umhüllende äußere Schicht aus Sphäroiden (Abb. 2b, Zusatzfilm 4). Schließlich verwendeten wir für grundlegende Segregationsexperimente Zebrafisch-Vorläuferzellen (Danio rerio), die vom induzierten Ektoderm oder Mesoderm dissoziiert wurden. Aggregate (n > 30) gemischter Ektoderm- und Mesodermzellen wurden mehrere Stunden lang abgebildet und schließlich trennten sich Ektodermzellen nach innen, während Mesodermzellen nach außen (Abb. 2c, Zusatzfilm 5), was den Erwartungen auf der Grundlage früherer Daten entsprach höhere homotypische Kontaktstärken für Ektodermzellen im Vergleich zu Mesodermzellen, gemessen nach mehreren Minuten Kontaktzeit23,33.

Repräsentative Epifluoreszenzbilder aus Bildserien von Segregationsexperimenten. a Trennung von primären Goldfisch-Keratinozyten (PFK, rot) und EPC-Fisch-Keratinozyten (EPC, grün). b 3D-Segregation von menschlichen A431-Epithelkarzinomzellen (A431, rot) und menschlichen HT1080-Fibrosarkomzellen (HT1080, grün). c Trennung von Zebrafisch-Ektoderm- (rot) und Mesoderm-Zellen (grün). Die linken Felder in (a–c) zeigen die Anfangsphase der Segregation und die rechten Felder zeigen die endgültige räumliche Konfiguration der getrennten homotypischen Domänen. Die Zeit nach dem ersten Mischen heterotypischer Zellsuspensionen ist in den unteren rechten Ecken angegeben, Maßstabsbalken: 100 µm. Siehe auch Zusatzfilme 3–5.

Die Zellsortierung ähnelt der Phasenordnung (Entmischung) in viskosen Flüssigkeiten20, wobei der Prozess durch Unterschiede in der Oberflächenspannung nicht vermischender Flüssigkeitskomponenten angetrieben wird. Die Aggregation und Segregation mehrerer Zellen wird durch die Oberflächenspannung des Gewebes vorangetrieben, die durch die kortikale Spannung der Zellen beeinflusst wird, die aus der Aktivität des Zytoskeletts, hauptsächlich der Kontraktilität von Actomyosin, resultiert.

Um eine quantitative Analyse der Segregationsdynamik zu ermöglichen, haben wir zunächst Analysetools entwickelt, um die Größe der sich bildenden homotypischen Zellcluster während der 3D-Segregation der Modellzelltypen zu messen. Mithilfe der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie erstellten wir Z-Serien fluoreszierender optischer Schnitte über mehrzellige Sphäroidaggregate, in denen die Zelltypen selektiv sichtbar gemacht und anhand ihrer jeweiligen Fluoreszenzfarbe identifiziert wurden. Wir verwendeten diese optischen 2D-Schnitte, die mit einer Z-Achsen-Auflösung von 10 Mikrometern aufgenommen wurden, was in etwa der Zellgröße entspricht, um 3D-Strukturen der sich trennenden Zellcluster zu rekonstruieren und die Größe der entstehenden 3D-Cluster der identifizierten Zelltypen zu messen. Die Clustergrößen wurden auf der Grundlage einer Zweipunktkorrelationsmethode berechnet, die innerhalb und zwischen den 2D-Abschnitten angewendet wurde und charakteristische Längendaten lieferte (siehe Einzelheiten unter Methoden). Die optischen Schnitte wurden nacheinander durchgeführt und ergaben Zeitreihen von Clustergrößendaten und Zeitraffervideos der rekonstruierten 3D-Strukturen. Nach dem anfänglichen Mischen beobachten wir, da homotypische Zelldomänen kontinuierlich verschmelzen und verschmelzen, einen charakteristischen Anstieg der durchschnittlichen Clustergrößen, bis die endgültige räumliche Konfiguration innerhalb unterschiedlicher Zeiträume erreicht wird, die für jedes Zelltyppaar spezifisch sind. Anschließend erreichen die Clustergrößen tendenziell ein Plateau (Abb. 3a, c, e: linke Felder).

Quantitative Analyse segregierender homotypischer Zelldomänengrößen. a Zeitabhängiges Wachstum getrennter Zelldomänen in gemischten Suspensionen von PKF- und EPC-Keratinozyten, unbehandelt (linkes Feld, n = 7) oder mit 100 µM Y27632 ROCK-Inhibitor behandelt (rechtes Feld, n = 4). b Repräsentative 3D-Rekonstruktionsbilder aus Zeitraffervideos von sich trennenden Clustern von PFK- (rot) und EPC-Keratinozyten (grün) nach 6-stündiger Trennung in Abwesenheit (linkes Feld) oder Vorhandensein (rechtes Feld) von ROCK-Inhibitor, siehe Zusatzfilm 6. c Analyse der Größe getrennter Zellcluster in A431-Keratinozyten- und HT1080-Fibrosarkom-Mischungen ohne (links, n = 6) oder mit 50 µM Y27632-Inhibitor (rechts, n = 6). d Repräsentative Bilder der Segregation von A431 (rot) und HT1080 (grün) in Abwesenheit (links) oder Anwesenheit (rechts) des Inhibitors nach 24-stündiger Segregation, siehe Zusatzfilm 7. e Analyse von segregierten Clustern in Ektoderm- und Mesodermmischungen von Zebrafischen ohne ( links, n = 8) oder mit 100 µM Y27632 (rechts, n = 6). f Repräsentative Bilder der Trennung von Ektoderm (rot) und Mesoderm (grün) in Abwesenheit (links) oder Anwesenheit (rechts) eines Inhibitors nach 15-stündiger Trennung, siehe Zusatzfilm 8. Fehlerstreifen stellen SEM in (a, c, e) dar. Die Zeit nach dem ersten Mischen heterotypischer Zellsuspensionen ist in den unteren rechten Ecken in (b, d, f) angegeben, Maßstabsbalken: 100 µm. Siehe auch ergänzende Abbildung 1.

Als nächstes störten wir die Kontraktilität von Actomyosin, indem wir die segregierenden Zellmischungen mit Y27632 behandelten, einem selektiven pharmakologischen Inhibitor der Rho-Kinase (ROCK), dem Hauptaktivator der kontraktilen Funktion von NM2. Für die verschiedenen Zelltyppaare verwendeten wir basierend auf früheren Daten34 unterschiedliche Inhibitorkonzentrationen im Bereich von 50 bis 100 µM. Wie erwartet führt die allgemeine ROCK-Hemmung zu einer verzögerten Segregation, die durch geringere Wachstumsraten der Clustergröße für alle drei Modellzelltyppaare gekennzeichnet ist und unterschiedliche Hemmungsempfindlichkeiten aufweist (Abb. 3a, c, e: rechte Felder). Dennoch ähnelte die endgültige räumliche Konfiguration der entstehenden homotypischen Domänen derjenigen, die bei unbehandelten Segregationsexperimenten beobachtet wurde. Die Zelltypen, die sich normalerweise im Inneren aufspalten, neigten immer noch dazu, die inneren Positionen unter ROCK-Hemmung einzunehmen, während die Verschmelzung entstehender innerer Cluster zu einem einzigen zentralen Cluster im Allgemeinen nicht innerhalb des normalen Zeitrahmens erfolgte (Abb. 3b, d, f, ergänzende Abb. 1, Ergänzende Filme 6–8).

Die Zellaggregation in Suspension und die Bildung von Sphäroidaggregaten hängen von der kortikalen Spannung der Zellen ab, die durch die Kontraktilität von Aktomyosin erzeugt wird, wenn Aktinfilamente durch bipolare Minifilamente aus Nicht-Muskel-Myosin 2 gedehnt und gezogen werden. Dies erfordert unter anderem die Selbstorganisation von NM2 zu Minifilamenten da NM2 allein oder sogar im dimeren Zustand Aktinfilamente nicht bewegen kann. Die Multimerisierung von NM2A, einer Isoform von NM2, kann durch die Bindung des S100A4-Proteins35 reguliert werden, wodurch der Zusammenbau von NM2 zu funktionellen Multimeren verhindert oder die Zerlegung bestehender Filamente erleichtert wird, wodurch die Zellkontraktilität gesteuert wird.

Um die kontraktile Funktion von Actomyosin zelltypspezifisch zu hemmen, verwendeten wir A431-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie die NM2A-Isoform exprimieren36. Wir haben Wildtyp S100A4 in einem Subklon von A431-Zellen (genannt A431-S100A4) überexprimiert. Zum Vergleich haben wir eine inaktive verkürzte mutierte Isoform von S100A4 (MutS100A4) in einem anderen A431-Subklon (genannt A431-ctrl), der als Negativkontrolle verwendet wurde, überexprimiert, ohne dass sich dies auf die NM2-Assemblierung auswirkte34. Western Blots weisen auf eine stabile Expression der Wildtyp- oder mutierten S100A4-Varianten in den A431-Subklonen hin (ergänzende Abbildung 2).

Wir haben diese A431-Subklone verwendet, um die Auswirkung einer verringerten Actomyosin-Kontraktilität auf die Zellaggregation zu untersuchen. Wir platzierten Suspensionen einer gleichen Anzahl von Zellen aus jedem A431-Subklon separat in nicht anhaftenden Aggregationskammervertiefungen und beobachteten die Bildung von Sphäroidaggregaten durch Zeitraffer-Videomikroskopie (Ergänzungsfilm 9, ergänzende Abbildung 3). Zur quantitativen Analyse der Aggregation haben wir den Umfang der Sphäroide als Umfang ihrer 2D-Projektion in der Bildserie gemessen (Abb. 4). Im Fall von A431-ctrl-Zellen (Negativkontrolle) verlief die Aggregation normal, gekennzeichnet durch abnehmende Umfänge, was runde Kugeln mit glatter Oberfläche ergab, genau wie normale A431-Zellsphäroide. Im Gegensatz dazu blieben A431-S100A4-Zellen mit verringerter Kontraktilität während des gesamten Aggregationsprozesses bei der Verdichtung zurück und ergaben weniger kompakte und größere Sphäroide, die durch höhere durchschnittliche Umfänge und eine beerenartige raue Oberfläche gekennzeichnet waren, ein bekannter Phänotyp, der auf eine verringerte Gewebeoberflächenspannung hinweist37,38.

Quantitative Analyse der Aggregation von A431-Zellen. a Zeitabhängige Abnahme des mittleren Umfangs von Sphäroiden, die aus einer homotypischen Zellsuspension von A431-Zellen aggregieren, die entweder den NM2-Assemblierungsinhibitor S100A4 (A431-S100A4, n = 10) oder seine inaktive mutierte Isoform (A431-ctrl, n = 10) überexprimieren. Fehlerstreifen stellen SEM dar, Sternchen (*) bei t = 24 h zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zum Student-t-Test an, p < 0,01. b Repräsentative Phasenkontrastbilder aus Zeitraffervideos von Sphäroiden von A431-ctrl-Zellen (linkes Feld) oder A431-S100A4-Zellen (rechtes Feld) nach 24-stündiger Aggregation aus der Suspension. Beachten Sie den Unterschied in der Rauheit der Sphäroidoberfläche. Maßstabsleiste: 100 µm. Siehe auch Zusatzfilm 9 und Zusatzabbildung 3. c, d Schematische Darstellungen von Oberflächenzellen, die die Zytoskelettkomponenten hervorheben, die an der Erzeugung kortikaler Spannung beteiligt sind. c Normale Zellen mit effektiver multizellulärer Verdichtung, gekennzeichnet durch einen großen Kontaktwinkel Θ aufgrund des kontrahierten Actomyosin-Netzwerks an der Zell-Medium-Oberfläche und entspanntem Actomyosin an der Zell-Zell-Grenzfläche, gekoppelt durch Cadherine. Der Zusammenbau von NM2-Monomeren zu Filamenten wird durch normale S100A4-Spiegel gesteuert, Auf- und Abbauprozesse werden durch den Doppelpfeil symbolisiert. d Experimentell erhöhte S100A4-Spiegel führen zur Sequestrierung von NM2-Monomeren und einer Verschiebung hin zur Zerlegung von Filamenten, was vermutlich zu einer Verschiebung hin zu einer verringerten kortikalen Actomyosin-Spannung und einer verringerten multizellulären Verdichtung führt. Symboldefinitionen werden im zentralen Textfeld angezeigt.

Während der 3D-Segregation von Zellen in heterotypischen Zellmischungen bilden sich homotypische Domänen und wachsen durch Fusion, und die Dynamik wird durch die für die einzelnen Zelltypen charakteristische Gewebeoberflächenspannung (TST) beeinflusst, die von der kortikalen Spannung der Zellen abhängt, die durch die Kontraktilität von Actomyosin erzeugt wird. Die entstehende räumliche Positionierung oder Geometrie der homotypischen Domänen hängt auch von der TST ab, da der Zelltyp, der durch einen höheren TST gekennzeichnet ist, allmählich innere Positionen einnimmt, während der andere, der durch einen niedrigeren TST gekennzeichnet ist, dazu neigt, in äußeren Positionen zu bleiben. Somit ist die räumliche Positionierung ein Hinweis auf die TST der segregierenden Zelltypen relativ zueinander. Um zu untersuchen, wie die Kontraktilität von Actomyosin die Oberflächenspannung des Gewebes und schließlich die räumliche Positionierung während der Segregation beeinflusst, verglichen wir den Segregationsprozess in zwei verschiedenen Zelltyppaarmischungen in nichtadhärenten Aggregationsvertiefungen. Rot fluoreszierend markierte HT1080-Fibrosarkomzellen wurden entweder mit A431-ctrl-Zellen, die den inaktiven Mutanten S100A4 überexprimieren, oder mit A431-S100A4-Zellen, die S100A4 überexprimieren, gemischt, was die Zellkontraktilität hemmt, indem es den NM2-Zusammenbau verhindert. Beide A431-Subklone exprimieren GFP für die Visualisierung grüner Fluoreszenz. Wir beobachteten die 3D-Segregation innerhalb der entstehenden Sphäroidaggregate durch Zeitraffer-Strukturbeleuchtungsmikroskopie und sammelten Z-Serien optischer Schnitte der sich bildenden homotypischen Zellcluster, die spezifisch durch ihre Fluoreszenzfarbe identifiziert wurden. Wir haben diese optischen Schnitte verwendet, um die durchschnittliche Clustergröße zu messen und die 3D-Struktur zu rekonstruieren, um die räumliche Positionierung der entstehenden Domänen zu verfolgen. Neben optischen Schnitten haben wir auch herkömmliche epifluoreszierende Bildserien für eine vergleichbare Visualisierung erstellt (Ergänzungsfilme 10 und 11). Wie aufgrund der Unterschiede in der Aggregationsdynamik von A431-Epithelkarzinom-Subklonen mit unterschiedlichen Zellkontraktilitätseigenschaften zu erwarten war (Abb. 4), war auch ihre Trennung von HT1080-Fibrosarkomzellen deutlich unterschiedlich. A431-Zellen, die die inaktive Mutante S100A4 (A431-ctrl) exprimierten, segregierten im Inneren der Sphäroide, während HT1080-Zellen dazu neigten, außerhalb zu bleiben (Abb. 5a, b), mit einer ähnlichen Clusterwachstumsdynamik und Konfiguration homotypischer Domänen wie bei der Segregation von normalem A431 und HT1080-Zellen (Abb. 3d, Abb. 2b). Im deutlichen Gegensatz dazu war die räumliche Konfiguration der segregierten Domänen im Fall von A431-Zellen, die Wildtyp S100A4 (A431-S100A4) exprimierten, umgekehrt, da diese Zellen eine langsamere Clusterwachstumsdynamik zeigten und schließlich zur Außenseite der Sphäroide segregierten, während HT1080-Zellen diesmal dazu neigten um die inneren Positionen einzunehmen (Abb. 5c, d). Diese umgekehrte räumliche Positionierung homotypischer Domänen weist darauf hin, dass eine stabile Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität in A431-S100A4-Zellen schließlich deren spezifische Gewebeoberflächenspannung unter die von HT1080-Zellen senkte (ergänzende Abbildung 4).

a Zeitabhängiges Wachstum getrennter Zelldomänen in gemischten Suspensionen von A431-Keratinozyten, die inaktive mutierte S100A4- (A431-ctrl) und HT1080-Fibrosarkomzellen überexprimieren (n = 6). b Repräsentative 3D-Rekonstruktion (linkes Feld) und gleichzeitige Epifluoreszenzbilder (rechtes Feld, Ansicht von unten) aus Zeitraffervideos von sich trennenden Clustern von A431-ctrl- (grün) und HT1080-Zellen (rot) nach 40 Stunden Trennung, siehe Zusatzfilm 10 . c Zeitabhängiges Wachstum getrennter Domänen in Mischungen von A431-Keratinozyten, die den NM2-Assemblierungsinhibitor S100A4 (A431-S100A4) überexprimieren, und HT1080-Fibrosarkomzellen (n = 6). d Repräsentative 3D-Rekonstruktion (linkes Feld) und Epifluoreszenzbilder (rechtes Feld, Ansicht von unten) von sich trennenden Clustern von A431-S100A4- (grün) und HT1080-Zellen (rot) nach 40-stündiger Trennung, siehe Zusatzfilm 11. Beachten Sie die umgekehrte Konfiguration von hier getrennte Domänen im Vergleich zu (b). Maßstabsleiste: 100 µm in (b, d). Fehlerstreifen stellen SEM in (a, c) dar. Siehe auch ergänzende Abbildung 4.

Die Kontaktstärke bei der Zellkopplung kann durch die experimentell messbare Trennkraft (Fs) von Zelldubletts und deren Kontaktwinkel charakterisiert werden (Abb. 1).

Die Zellkortexspannung, die durch die Kontraktilität von kortikalem Actomyosin erzeugt wird, spielt eine wichtige Rolle bei der Kontaktbildung und -ausdehnung. Es wurde bereits früher gezeigt, dass für eine wirksame Kontaktausdehnung eine verringerte Kortexspannung an der Zell-Zell-Grenzfläche im Vergleich zur Zell-Medium-Grenzfläche erforderlich ist23. Um die Rolle dieser lokalisierten Abstimmung der kortikalen Spannung bei der Kontaktbildung zu untersuchen, haben wir in die Regulierung der Actomyosin-Kontraktilität der Zellen eingegriffen. Um die Interpretation unserer Experimente zu erleichtern, haben wir eine schematische Abbildung zusammengestellt, die Folgendes zusammenfasst: (i) aktuelles Wissen über die Regulierung des Zytoskeletts durch Zelladhäsionsmoleküle, (ii) die wichtigsten physikalischen Komponenten, die die Gewebeoberflächenspannung erzeugen, wie sie derzeit bekannt sind2,3,23 und (iii) die erwarteten Konsequenzen unserer experimentellen Eingriffe in die Regulierung der Zellkontraktilität (Abb. 6).

a Signalübertragung von Zelladhäsionsmolekülen an das Zytoskelett. Die Transbindung von Zelloberflächen-Cadherinen kontaktierender Zellen führt zu einer verminderten Actomyosin-Kontraktilität und kortikalen Spannung an der Zell-Zell-Grenzfläche (Tcc). Grüne Pfeile zeigen die Aktivierung an und das rote Symbol steht für die Hemmung. Eine detaillierte Beschreibung dieser Signalkaskade und Referenzen sind in der Diskussion enthalten. b Zusammenfassung der Erzeugung der Gewebeoberflächenspannung (TST) durch Zellen in einem Aggregat, dargestellt als übliche schematische Darstellung. Die kortikale Zellspannung an der Zell-Medium-Grenzfläche (Tcm) und die Adhäsionsspannung (Acc) tragen positiv zum TST bei, während die kortikale Spannung an der Zell-Zell-Grenzfläche (Tcc) einen negativen Beitrag leistet. Spannungen werden durch Pfeile dargestellt. Als Orientierungshilfe für das Auge ist ein Kontaktwinkel Θ durch gestrichelte Linien angegeben. c, d Schematische Bilder von Zellaggregaten mit Schlüsselkomponenten der kortikalen Spannungsregulation, hervorgehoben durch Symbole, um die experimentellen Eingriffe zu erklären. c Normale Zellen an der Oberfläche des Aggregats zeigen eine effektive multizelluläre Verdichtung, gekennzeichnet durch einen großen Kontaktwinkel Θ aufgrund eines entspannten Actomyosin-Netzwerks an der Zell-Zell-Grenzfläche und eine niedrige kortikale Spannung aufgrund der Signalübertragung von trans-gebundenen Cadherinen. d Genetisch manipulierte Zellen, die die konstitutiv aktive ROCK-Isoform exprimieren, von der erwartet wird, dass sie die Kontraktilität von Actomyosin an der Zell-Zell-Grenzfläche unabhängig vom inaktiven endogenen ROCK hier ständig aktiviert. Die vorgeschlagene Auswirkung besteht darin, dass caROCK eine höhere kortikale Spannung an der Zell-Zell-Grenzfläche aufrechterhält, was zu einer verringerten TST und einer weniger effektiven Verdichtung führt, die durch einen kleineren Kontaktwinkel gekennzeichnet ist. Symboldefinitionen werden im zentralen Textfeld angezeigt.

Als Modellzelltyp wählten wir Zebrafisch-Ektodermzellen, die sich durch eine hohe Trennkraft (Fs) und einen hohen Kontaktwinkel in Zelldubletts23 sowie eine Segregationspositionierung im Inneren bei Mischung mit Mesodermzellen auszeichnen, was auf eine höhere Gewebeoberflächenspannung für Ektoderm hinweist (Abb. 2c, Abb . 3f). Mithilfe einer caROCK-mRNA, die in Zebrafischembryonen mikroinjiziert wurde und zur Bildung von Ektodermzellen angeregt wurde (Einzelheiten siehe Methoden), überexprimierten wir eine konstitutiv aktive ROCK-Isoform, die ständig Nicht-Muskel-Myosin 2 (Ektoderm-caROCK) aktiviert. Für eine vergleichbare Negativkontrolle verwendeten wir normale Ektodermzellen, die von Ektoderm-induzierten Embryonen dissoziiert wurden (Ektoderm-ctrl).

Zuerst haben wir den Kontaktwinkel Θ von homotypischen Zelldubletts gemessen, die zufällig in Suspensionen von Ektoderm-caROCK-Zellen auf nicht anhaftendem Substrat in 30 Minuten gebildet wurden, und sie mit Ektoderm-ctrl-Zelldubletts verglichen, die unter ähnlichen Bedingungen gebildet wurden. Die Überexpression von caROCK verringerte den Kontaktwinkel signifikant, wie durch den an Zelldublettdaten durchgeführten Student-t-Test (p < 0,001) gestützt (Abb. 7).

a Schematische Darstellung eines homotypischen Zelldubletts nach Kontaktbildung. Der Kontaktwinkel Θ wird als Orientierung für das Auge durch Linien angezeigt. b Quantitative Analyse der Kontaktwinkel homotypischer Dubletts unbehandelter Ektodermzellen (Ektoderm-ctrl, n = 170) oder Ektodermzellen, die konstitutiv aktives ROCK überexprimieren (Ektoderm-caROCK, n = 210). Die Kontaktwinkel wurden nach 30 Minuten Kontaktbildung gemessen. Medianwerte werden durch rote und blaue Linien hervorgehoben, ein Sternchen (*) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zum Student-t-Test an, p < 0,001. c, d Repräsentative Phasenkontrastbilder frei anhaftender homotypischer Zelldubletts in Ektoderm-ctrl- (c) oder Ektoderm-caROCK-Suspensionen (d) nach 30 Minuten. Beachten Sie den Unterschied zwischen (c) und (d) in den Kontaktwinkeln, der durch gelbe Linien als Orientierung für das Auge hervorgehoben ist. Zahlen sind Kontaktwinkel-IDs für die Analyse. Maßstabsleiste: 20 µm.

Als nächstes untersuchten wir die Aggregationsdynamik von caROCK-exprimierenden Ektodermzellen und verglichen sie mit Ektoderm-ctrl-Zellen. Wir haben separate homotypische Zellsuspensionen einer ungefähr gleichen Anzahl von Zellen dieser beiden Zelltypen in nicht anhaftende Aggregationskammervertiefungen gegeben und ihre Aggregation zu Sphäroiden durch Zeitraffer-Videomikroskopie abgebildet (Zusatzfilm 12). Zur quantitativen Analyse haben wir während des gesamten Aggregationsprozesses den Umfang der 2D-Projektion von Sphäroiden in der Bildserie gemessen und zeitabhängige Umfangsdaten mit dem anfänglichen Umfang jedes Sphäroids normalisiert. Bei normalen Ektoderm-Kontrollzellen verringerten sich die durchschnittlichen Sphäroidumfänge, was zu kompakten Sphäroiden mit glatten Oberflächen führte. Umgekehrt war die Ektoderm-caROCK-Aggregation langsamer, was zu weniger kompakten Sphäroiden führte, die durch höhere Umfänge und raue, beerenartige Oberflächen gekennzeichnet waren, ein Hinweis auf eine verringerte Gewebeoberflächenspannung, die diese Zellen charakterisiert (Abb. 8a, b).

Quantitative Analyse der Aggregation von Zebrafisch-Ektodermzellen. a Zeitabhängige Abnahme des mittleren Umfangs von Sphäroiden, die aus homotypischen Zellsuspensionen von entweder unbehandelten Ektodermzellen (Ektoderm-ctr, n = 20) oder Ektodermzellen, die konstitutiv aktives ROCK überexprimieren (Ektoderm-caROCK, n = 20), aggregieren. Sphäroidumfänge werden mit normalisiert und als Prozentsatz der anfänglichen Umfänge aufgetragen, Fehlerstreifen stellen SEM dar, Sternchen (*) bei t = 10 h zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied mit dem Student-t-Test an, p < 0,01. b Repräsentative Phasenkontrastbilder aus Zeitraffervideos von Sphäroiden von Ektoderm-ctrl-Zellen (linkes Feld) oder Ektoderm-caROCK-Zellen (rechtes Feld) nach 10 Stunden Aggregation. Beachten Sie den Unterschied in der Rauheit der Sphäroidoberfläche. Maßstabsleiste: 100 µm. Siehe auch Zusatzfilm 12. c–f Immunfluoreszenznachweis der leichten Phospho-Myosin-Kette (p-MLC) in Sphäroiden von Ektodermzellen. c, d Ektoderm-ctrl-Sphäroid mit nur p-MLC-Markierung (c) oder zusammengeführtes Bild von p-MLC-Markierung (gelb) und NucBlue-Markierung (blau). e, f Ein Sphäroid aus Ektoderm-caROCK-Zellen, markiert für p-MLC (e) oder zusammengeführtes Bild der p-MLC-Markierung (gelb) und der NucBlue-Färbung (blau). Zellkerne werden durch NucBlue-Färbung sichtbar gemacht. Beachten Sie, dass das p-MLC-Immunfluoreszenzsignal in (c) kaum zu sehen ist, während es nach der Einführung von caROCK in (e) viel ausgeprägter ist. Maßstabsbalken: 10 µm in c–f.

Um die Auswirkung der caROCK-Überexpression auf die Myosinaktivität zu verifizieren, verwendeten wir diese Sphäroide zum Immunnachweis der phosphorylierten Form des Myosin-regulatorischen Leichtkettenproteins (MLC). MLC wird hauptsächlich durch ROCK phosphoryliert, wodurch NM2 in seinen aktiven Zustand versetzt wird, sodass es sich zu Filamenten zusammenfügen und schließlich Aktinfilamente gemäß dem Lymn-Taylor-Funktionszyklus des Actomyosin-Komplexes bewegen kann. Daher sind der Spiegel und die subzelluläre Lokalisierung von Phospho-MLC ein Hinweis auf die Kontraktilität von Actomyosin. Im Vergleich zu Ektoderm-ctrl-Zellen zeigten die Ektoderm-caROCK-Zellen in allen Aggregaten, einschließlich der Hauptregion, erheblich erhöhte p-MLC-Immundetektionsniveaus, was auf eine erhöhte Actomyosin-Kontraktilität dort hinweist (Abb. 8c – f).

Die räumliche Konfiguration homotypischer Zelldomänen, die im Verlauf der 3D-Segregation in heterotypischen Zellmischungen gebildet werden, ist ein Hinweis auf die Gewebeoberflächenspannungen, die die spezifischen Zelltypen charakterisieren. Die Bildung von Zell-Zell-Kontakten erfordert eine lokale Verringerung der kortikalen Spannung an der Zell-Zell-Grenzfläche, die durch eine lokale Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität erreicht werden kann, eine Hypothese, die wir testen wollten.

Um die Rolle der lokalisierten Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität an Zell-Zell-Grenzflächen zu untersuchen, verwendeten wir Zebrafisch-Ektodermzellen, die eine konstitutiv aktive ROCK-Isoform (Ektoderm-caROCK) überexprimierten und so eine solche lokalisierte Hemmung außer Kraft setzten. Ektoderm-caROCK-Zellen zeichnen sich im Vergleich zu normalen Ektoderm-ctrl-Zellen durch verminderte Aggregationseigenschaften und eine verringerte Gewebeoberflächenspannung aus (Abb. 8).

Wir haben Zebrafisch-Mesodermzellen in gleichen Mengen entweder mit Ektoderm-ctrl-Zellen oder Ektoderm-caROCK-Zellen in nicht anhaftenden Aggregationsvertiefungen gemischt und ihre Segregation durch Zeitraffer-Strukturbeleuchtungsmikroskopie in Kombination mit konventioneller Epifluoreszenzmikroskopie beobachtet (Ergänzungsfilme 13 und 14). Während des Segregationsprozesses haben wir Z-Serien optischer Schnitte der spezifisch identifizierten homotypischen Zellcluster gesammelt, um die Clustergrößen zu messen und die 3D-Struktur zu rekonstruieren, die die räumliche Konfiguration der entstehenden homotypischen Domänen offenlegt.

Ektoderm-ctrl-Zellen trennten sich im Inneren von Sphäroiden und hinterließen Mesoderm-Zellcluster an äußeren Positionen (Abb. 9b), während die Dynamik des Clusterwachstums und die räumliche Konfiguration denen anderer Tests mit diesen Zelltypen ähnelten (Abb. 2c, Abb. 3e). Als deutlicher Kontrast wurde die Segregationskonfiguration von Ektoderm-caROCK-Zellen mit Mesodermzellen umgekehrt (Abb. 9d). Mesodermzellen neigten nun dazu, sich bei normaler Zellcluster-Wachstumsdynamik in die Innenseite von Sphäroiden abzusondern, während die Wachstumsrate von Ektoderm-caROCK-Clustern stetig verringert wurde (Abb. 9c) und sich Ektoderm-caROCK-Cluster als Hinweis auf eine verringerte Gewebeoberfläche nach außen absonderten Spannung (ergänzende Abbildung 5). Dies steht im Einklang mit der verringerten Gewebeoberflächenspannung, die bei der Aggregation von Ektoderm-caROCK-Zellen beobachtet wird (Abb. 8) und stützt die Behauptung, dass konstitutiv aktives ROCK die lokale Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität an der Zell-Zell-Grenzfläche verhindert, die normalerweise für eine effektive Kontaktbildung erforderlich ist Expansion und schließlich Erzeugung einer hohen Gewebeoberflächenspannung.

a Zeitabhängiger Anstieg der mittleren Größe getrennter Zellcluster in Aggregaten (n = 16), die sich in gemischten Suspensionen normaler Zebrafisch-Ektodermzellen (Ektoderm-ctrl) und Mesodermzellen bilden. b Repräsentative 3D-Rekonstruktion (linkes Feld) und gleichzeitige Epifluoreszenzbilder (rechtes Feld, Ansicht von unten) aus Zeitraffervideos von sich trennenden Clustern von Ektoderm-Strg-Zellen (rot) und Mesodermzellen (grün) nach 12 Stunden Trennung, siehe Zusatzfilm 13 . c Zeitabhängiges Wachstum getrennter Zellclustergrößen in Aggregaten (n = 15) gemischter Ektodermzellen, die konstitutiv aktive ROCK- (Ektoderm-caROCK) und Mesodermzellen überexprimieren. d Repräsentative 3D-Rekonstruktion (links) und Epifluoreszenzbilder (rechts, Ansicht von unten) von sich segregierenden Clustern von Ektoderm-caROCK-Zellen (rot) und Mesodermzellen (grün) nach 12 Stunden Segregation, siehe Zusatzfilm 14. Beachten Sie die umgekehrte räumliche Konfiguration der Segregation Domänen hier im Vergleich zu Panel (b). Maßstabsleiste: 100 µm in (b, d). Fehlerstreifen stellen SEM in (a, c) dar. Siehe auch ergänzende Abbildung 5.

Die Hauptmechanismen, die bei der Entwicklung einer befruchteten Eizelle zu einem voll entwickelten Embryo ablaufen, sind noch nicht vollständig verstanden, aber einige der Bestandteile des Prozesses lassen sich als dominiert durch Diffusion, spontane kollektive Migration und Migration aufgrund einiger Leitsignale identifizieren (z. B. Gradienten von Chemokinen und/oder Wachstumsfaktoren)18. Vor dem Hintergrund der obigen Überlegungen waren wir motiviert, zwei Aspekte der Entstehung der Morphologie während der 3D-Zellsegregation zu untersuchen: (i) wir testeten, ob die Schlussfolgerungen früherer Studien über die Musterbildung segregierender Zebrafisch-Vorläuferzellen auf ein breiteres Spektrum von Wirbeltieren zutreffen Zellen und (ii) wir haben eine rechnerische Analyse auf die Zeitraffer-3D-Aufzeichnungen angewendet, die den Weg für die Analyse der relativen Rollen der Diffusions- und Gruppenbewegungsmechanismen während der Segregation ebnet.

Die beiden Modalitäten – Diffusion und kollektive Bewegung – führen zu unterschiedlichen charakteristischen Zeitabhängigkeiten. Während der Segregation zweier Zelltypen mit etwa gleicher Anzahl sagt die Theorie voraus, dass die charakteristische lineare Größe homotypischer Zellcluster mit der Zeit als Potenzgesetz gemäß tz mit z = 1/3 zunimmt, während die kohärente Bewegung von Zellen gleich ist Der Typ führt entsprechend zu einer viel schnelleren Segregationsgeschwindigkeit, die durch ein lineares Wachstum der Clusterdurchmesser mit z = 1 gekennzeichnet ist39. Da einer der Schwerpunkte unserer Studie auf der Zeitabhängigkeit des Segregationsgrads liegt, war es wichtig, dass wir unsere gemessenen Zellkonfigurationen mit einer etablierten Methode analysierten, die der statistischen Physik entlehnt war und auf der Bestimmung der sogenannten Dichtekorrelationsfunktion beruhte. Unsere quantitativen Daten zur Dynamik verschiedener In-vitro-Modelle der 3D-Zellsegregation können für zukünftige Studien zur rechnerischen Modellierung der 3D-Segregation genutzt werden.

Die Gewebeoberflächenspannung (TST) ist eine wichtige biomechanische Eigenschaft, die die mehrzellige Organisation charakterisiert und für die Selbstorganisation des Gewebes erforderlich ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine schnittstellenspezifische Regulierung der Kortexspannung für die Bildung von Zell-Zell-Kontakten erforderlich ist und eine aktive Reduzierung der Kortexspannung an Zell-Zell-Grenzflächen beinhaltet. Während der Zellkontaktbildung und -aggregation ändert sich die Lokalisierung von nicht-muskulärem Myosin 2 (NM2) an Grenzflächen: Es reichert sich an Zell-Medium-Grenzflächen an, wohingegen es an Zell-Zell-Grenzflächen erschöpft ist, was bedeutet, dass die schnittstellenspezifische kortikale Spannungsregulation die Schnittstelle betrifft -spezifische Rekrutierung von NM221,23. Die Kontaktstärke zweier sich berührender Zellen kann durch die Trennkraft charakterisiert werden, die experimentell ex vivo durch den Dual Pipette Aspiration (DPA)-Assay messbar ist. Neben der Trennkraft gibt auch der Kontaktwinkel, der die kontaktierenden Zellen charakterisiert, Aufschluss über die Kontaktstärke, da höhere Kontaktwinkel mit höheren Trennkräften einhergehen. Die Kontaktstärke hängt von Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche ab, die einen positiven Beitrag leisten und auch durch ihre Verankerung am Zytoskelett begrenzt werden, während ein negativer Beitrag von der Spannung der Zellrinde an der Kontaktstelle herrührt. Die kortikale Spannung am Kontakt wird während der Kontaktbildung von Keimschicht-Vorläuferzellen aktiv reduziert, was mit einer Reduzierung von NM2 im Kontaktbereich einhergeht23.

Studien in Epithelkulturen haben Regulationsmechanismen aufgedeckt, durch die die Cadherin-Transbindung an der Zell-Zell-Schnittstelle die Signalübertragung an das Zytoskelett initiiert26,40. Der implizierte Mechanismus beinhaltet die Rekrutierung von p120-Catenin in Cadherin-Komplexen28, wobei p120-Catenin die RhoA-Aktivität lokal27 durch die Rekrutierung von p190RhoGAP30 hemmt. Die Hemmung von RhoA führt zu einer weiteren Downstream-Inaktivierung von ROCK und schließlich zu einer Herunterregulierung der NM2-Aktivität. Alpha-Catenin trägt zur Bindung und Funktion von p120-Catenin bei41 und die Bedeutung dieser Wechselwirkung wird durch Studien belegt, die zeigen, dass der Verlust von Alpha-Catenin in embryonalen Zellaggregaten zu einer verringerten Gewebeoberflächenspannung führt42. Die Signalkaskade, die von trans-gebundenen Cadherinen ausgeht, reguliert schließlich die Kontraktilität von NM2-basiertem Actomyosin herunter und ermöglicht so eine lokale Kontrolle der kortikalen Spannung (Abb. 6). NM2 kann auch als Mechanosensor fungieren, da mechanische Spannung seine Assoziation mit Aktin stabilisiert25,43 und somit die Rekrutierung von NM2 in Bereiche mit hoher kortikaler Spannung zusätzliche Möglichkeiten zur ortsspezifischen Regulierung des kortikalen Zytoskeletts bieten kann.

In dieser Studie haben wir verschiedene Methoden angewendet, um die Kontraktilität von Actomyosin zu stören, und die 3D-Segregation mehrerer Modellzelltyppaare als funktionelle Anzeige analysiert, um die Auswirkung solcher Störungen zu untersuchen. Wir zeigen, dass die allgemeine Hemmung von ROCK durch den zellpermeablen Inhibitor Y27632 die TST verringert und dadurch die Segregation verzögert und verlangsamt, die endgültige räumliche Konfiguration der segregierten Domänen jedoch kaum beeinflusst wird (Abb. 3). Zelltypen, die durch eine hohe TST gekennzeichnet sind und sich unter normalen Bedingungen im Inneren segregieren, taten dies unter allgemeiner ROCK-Hemmung weiterhin, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der NM2-Aktivität in beiden segregierenden Zelltypen den Unterschied zwischen ihren jeweiligen TST nicht wesentlich verändert. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass in Ermangelung erheblicher NM2-basierter kortikaler Spannungen die ungestörten Unterschiede in der Adhäsionsspannung nun die TST-Erzeugung dominieren und zu einer langsameren Segregation führen können. Eine alternative Interpretation besteht darin, dass die angewendeten Konzentrationen des ROCK-Inhibitors, obwohl sie für die untersuchten Zelltypen im hohen Bereich liegen34, zelltypspezifisch unterschiedliche restliche NM2-Aktivitäten ermöglichen können, die unterschiedliche kortikale Spannungen verursachen und zu unveränderten Segregationskonfigurationen führen.

Eine quantitative Analyse der Dynamik der Segregation kann hier die Empfindlichkeit der Dynamik gegenüber einer allgemeinen Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität aufdecken und dies kann auch die unterschiedlichen Beiträge von kortikalen Spannungen und Adhäsionsspannungen zur TST-Erzeugung aufdecken. Die Wachstumsrate der Clustergröße bei der Keratinozytensegregation wird durch die Actomyosin-Hemmung kaum beeinflusst (Abb. 3a), was auf einen höheren Beitrag der Adhäsion zur TST-Erzeugung im Vergleich zur Segregation von A431- und HT1080-Zellen hinweist, wo die Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität die Segregation erheblich verlangsamt (Abb. 3c), was auf den höheren Beitrag kortikaler Spannungen zum TST hinweist. Weitere Tests, die den Beitrag der Actomyosin-Kontraktilität und der auf Cadherin basierenden Adhäsionsspannung zu TST31 untersuchen, wären erforderlich, um dieses Phänomen genauer zu interpretieren, was eindeutig außerhalb des Rahmens dieser Arbeit liegt.

Wir zeigen, dass die zelltypspezifische Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität durch die Hemmung der NM2-Assemblierung zu funktionellen Filamenten durch S100A4 die TST reduziert, die diesen Zelltyp charakterisiert. Diese Verringerung äußert sich in Segregationskonfigurationen, die von den beiden menschlichen Gewebezelltypen erzeugt werden, wobei früher innen positionierte Epithelzellen aufgrund ihres Mangels an funktionell zusammengesetzten NM2-Filamenten nun nach außen getrennt sind (Abb. 5). Die Hemmung der NM2-Assemblierung in der gesamten Zelle führt auch zu einer verringerten Verdichtung homotypischer Zellaggregate und zum Fehlen gestreckter Zellen an der Oberfläche der sich bildenden Sphäroide (Abb. 4), was auf die Entstehung kortikaler Spannung an der Zell-Medium-Grenzfläche hinweist, die der Hauptantrieb ist des Aggregationsprozesses hängt eindeutig von der funktionellen Actomyosin-Struktur ab. Beachten Sie hier, dass S100A4 nur die NM2A-Isoform35 hemmt und die verschiedenen NM2-Isoformen möglicherweise unterschiedliche Rollen bei der Regulierung der kortikalen Spannung spielen. Dies steht jedoch nicht im Widerspruch zu unserer Schlussfolgerung, dass TST durch Hemmung der NM2-Assemblierung reduziert werden kann. Eine ähnliche Verringerung der TST wurde bereits früher21 bei der allgegenwärtigen Inaktivierung von NM2 durch die Expression einer dominant negativen ROCK-Isoform in Zebrafisch-Ektodermzellen nachgewiesen, was auf einen universellen Mechanismus bei Zelltypen unterschiedlicher Herkunft schließen lässt.

Schließlich und wichtig ist, dass wir zeigen, dass, wenn die schnittstellenspezifische Regulierung der kortikalen Spannung durch die Expression einer konstitutiv aktiven ROCK-Mutante in Zebrafisch-Ektodermzellen, einem Zelltyp, der normalerweise durch einen hohen TST gekennzeichnet ist und sich im Inneren von Mesodermzellen trennt, außer Kraft gesetzt wird, diese Ektodermzellen sich nun trennen außen, was auf eine verringerte TST hinweist (Abb. 9). Charakteristisch ist auch eine leicht verzögerte und verringerte Verdichtung während der multizellulären Aggregation von caROCK-exprimierenden Ektodermzellen sowie das Auftreten von locker anhaftenden runden Zellen an der Oberfläche dieser Sphäroide, was auf eine Tendenz zu verringertem TST hinweist, während die Aktivität von NM2, beurteilt durch Immunfluoreszenz, war auch in diesen Sphäroiden erhöht (Abb. 8). Wichtig ist, dass wir bei der Bildung homotypischer Ektoderm-Zelldubletts in Kultur durch Zell-Zell-Adhäsion eine Tendenz zu verringerten Kontaktwinkeln in caROCK-exprimierenden Zelldubletts beobachten (Abb. 7), was hier ein Hinweis auf eine erhöhte Zell-Zell-Grenzflächenspannung ist.

Alle diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass caROCK, das nicht herunterreguliert werden kann, NM2 ständig aktiviert und somit die Kontraktilität von Actomyosin an allen Stellen der Zellrinde hoch hält, während die kortikale Spannung normalerweise an der Zell-Zell-Grenzfläche aufgrund der Inaktivierung von endogenem ROCK reduziert werden sollte Signalübertragung von trans-gebundenen Cadherinen hier. Umgekehrt wird endogenes ROCK aufgrund eines Mangels an trans-gebundenen Cadherinen an der Zell-Medium-Grenzfläche dort durch diesen Signalweg nicht inaktiviert und hält die Kontraktilität von Actomyosin hoch, was durch caROCK weiter erhöht werden kann. Denn TST hängt in erster Linie von der Differenz der kortikalen Spannung an der Zell-Medium-Grenzfläche (Tcm) und der kortikalen Spannung an der Zell-Zell-Grenzfläche (Tcc) ab, mit einem geringen Beitrag der Zell-Zell-Adhäsionsspannung (Acc), da TST ≈ Tcm-Tcc+ Acc/2 im Allgemeinen2,3,23,42, dieser Unterschied ist in caROCK-exprimierenden Zellen aufgrund ihrer verminderten Fähigkeit, die kortikale Spannung an der Zell-Zell-Grenzfläche zu reduzieren, verringert, während der geringfügige Beitrag der Zell-Zell-Adhäsionsspannung nicht angenommen wird ändern (Abb. 6).

Die oben genannten Ergebnisse liefern im Vergleich zu früheren Studien21,23 gemeinsam den experimentellen Beweis, dass die schnittstellenspezifische Abstimmung der kortikalen Spannung durch die lokale Regulierung des Actomyosin-Kontraktilsystems durch ROCK die TST mehrzelliger Strukturen bestimmt, was deren Selbstorganisation, einschließlich Segregation, vorantreibt . Zelltypspezifische Eingriffe in die Regulierung der NM2-Aktivität oder des NM2-Zusammenbaus zu funktionellen Filamenten können als potenzielle Werkzeuge zur Modulation von TST und schließlich der Gewebeselbstorganisation in den aufstrebenden Bereichen des Tissue Engineering eingesetzt werden.

Der in dieser Studie verwendete Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) wurde in der Fischanlage der ELTE Eötvös Loránd-Universität gemäß Standardprotokollen gehalten und gezüchtet44,45. Alle in dieser Studie verwendeten Protokolle wurden vom Ungarischen Nationalen Amt für Lebensmittelkettensicherheit genehmigt (Genehmigungsnummer: XIV-I-001/515-4/2012). Die in dieser Studie verwendeten Goldfische (Carassius auratus) wurden in der Abteilung für Biologische Physik der Eötvös-Loránd-Universität unter Standardaquarienbedingungen gehalten, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität genehmigt wurden.

Die Plasmide pCS2+cyclops, pCS2+lefty1, pCS2+mCherry-H2A, pCS2+EGFP-H2B wurden zur Herstellung von mRNA für Mikroinjektionen verwendet. Konstitutiv aktives ROCK (ca-ROCK) CDS wurde ebenfalls aus dem pCAG-myc-p160∆3-Konstrukt46 in das pCS2+-Rückgrat kloniert, eine freundliche Spende von Jeffery Amack (State University of New York Upstate Medical University). Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym KpnI linearisiert und in vitro mit dem mMessage mMachine SP6-Kit (Ambion, AM1340) gemäß dem Protokoll des Herstellers transkribiert.

Zellkulturen aus Primärzellen oder im Handel erhältlichen Zelllinien wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma D6429) gehalten, das 4 mM L-Glutamin enthielt, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS, GIBCO) und Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (Lonza), in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2-Atmosphäre in Gewebekultur-6-Well-Platten oder Kulturschalen (Greiner) bei 37 °C oder 25 °C, je nach Zelltyp. Zellkulturen aus dissoziierten Zebrafischembryonen wurden für Experimente in CO2-unabhängigem Medium (GIBCO), ergänzt mit 10 % FCS (GIBCO), 4 mM L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (Lonza), in einem befeuchteten Inkubator bei 28 °C aufbewahrt C.

Primäre Fischkeratinozyten wurden wie zuvor beschrieben aus Schuppen von Goldfischen (Carassius auratus) isoliert47. Kurz gesagt, ohne den Goldfisch zu opfern, wurden einige Schuppen isoliert und einen Tag lang in DMEM-10 % FCS-Kulturmedium aufbewahrt, während Keratinozyten aus den Schuppen in die Kulturschale wanderten. Die EPC-Fisch-Keratinozyten-Zelllinie wurde von ATCC (CRL-2872) erworben und in DMEM-10 % FCS-Medium gehalten.

Zellsuspensionen wurden aus beiden Keratinozytenkulturen nach kurzer Inkubation in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,1 M Phosphat, 0,9 % NaCl, pH 7,4, GIBCO) hergestellt und für Experimente in CO2-unabhängiges Medium – 10 % FCS bei 25 °C übertragen.

Die menschliche Epithelkarzinomzelllinie A431 (CRL-1555) und die menschliche Fibrokarzinomzelllinie HT1080 (CCL-121) wurden von ATCC erhalten und in DMEM-10 % FCS bei 37 °C kultiviert. A431- oder HT1080-Monoschichtkulturen wurden kurz mit 0,5 mg/ml Trypsin und 0,2 mg/ml EDTA (Sigma) in PBS (GIBCO) inkubiert, dann wurden die Zellen gespült und für Experimente in Suspensionen in ein Kulturmedium überführt.

Durch Mikroinjektion von Lefty1-mRNA (100 pg) für Ektoderm oder Cyclops-mRNA (100 pg) für Mesoderm wurde bei Embryonen im 1-Zell-Stadium die Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen (Danio rerio) aus nur einem Keimblatt-Vorläuferzelltyp bewirkt. Die Fluoreszenzmarkierung wurde durch Co-Injektion im 1-Zell-Stadium mit mRNA (200 pg) erreicht, die entweder Histon2A-mCherry kodierte, was zu rot markierten Kernen im Ektoderm führte, oder Histon2B-EGFP, was zu grünen Kernen im Mesoderm führte. Um ektodermale Zellen mit veränderter Rho-Kinase-Aktivität zu erzeugen, injizierten wir lefty1- und EGFP-H2A-mRNAs mit caROCK-mRNA (100 pg). Embryonen wurden in L15-Medium (Sigma, L1518) bei 28,5 °C bis zum Kugelstadium (4 hpf) gehalten und dann für Experimente mechanisch in Einzelzellsuspensionen in CO2-unabhängigem Medium-10 % FCS bei 28 °C dissoziiert.

Unmarkierte Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen für die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung markiert. Im Allgemeinen wurden alle Zelltypen oder Zelllinien durch Inkubation mit den Farbstoffen unter Monoschichtkulturbedingungen in DMEM-10 % FCS-Kulturmedium markiert. Primäre Goldfisch-Keratinozyten und humane A431-Epithelkarzinomzellen wurden 90 bzw. 30 Minuten lang mit 10 µM CellTracker Red CMTPX (Invitrogen, C34552) markiert. EPC-Fischkeratinozyten und menschliche HT1080-Fibrosarkomzellen wurden 90 bzw. 30 Minuten lang mit 5 µM CellTracker Green CMFDA (Invitrogen, C7025) markiert.

Zebrafisch-Ektoderm-Zellaggregate wurden 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und 10 Minuten lang in 0,1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Die unspezifischen Bindungsstellen wurden durch 2-stündige Inkubation in einem Kulturmedium mit 10 % Serum blockiert. Primärantikörper gegen phosphorylierte (pS19) Myosin-Leichtkette (Kaninchen, polyklonal, Anti-MYL12A-Phospho S19, Abcam ab2480) wurden in einer 1/100-Verdünnung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 °C aufgetragen. Mit AlexaFluor-555 (Southern Biotech, 4030-32) konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper wurde in einer 1/200-Verdünnung 4 Stunden lang bei Raumtemperatur verwendet. Auf alle Inkubationen folgten drei einstündige Waschschritte in PBS. Schließlich wurden immunmarkierte Aggregate unter Verwendung eines Eindeckmediums (Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Stain, Invitrogen, P36981), das NucBlue-Gegenfärbung enthielt, auf Objektträger (Thermo Scientific) montiert, um Zellkerne sichtbar zu machen. Fluoreszierende Markierungen wurden mit einem Zeiss Axio Observer Z1-Mikroskop mit Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0,75- oder Olympus A 100x/1,3-Objektiven und einer Zeiss AxioCam MRm CCD-Kamera abgebildet. Die Bilder wurden mit der NIH ImageJ-Software verarbeitet.

Aggregations-Mikrowellkammern wurden hergestellt, indem geschmolzene flüssige 2 %ige Agarose (Invitrogen) in PBS gegossen und in einer PDMS-negativen Form (3D-Petrischale, Microtissues) gelieren gelassen wurde, die Säulen enthielt, die nicht haftende Wells mit einem Durchmesser und einer Tiefe von 800 µm definieren . Nach der Entnahme aus der Negativform wurden die Agarosegelkammern 2 Stunden lang mit Kulturmedium äquilibriert, bevor etwa 3000 Zellen in Suspension in jede Mikrovertiefung überführt wurden.

Um die Kontraktilität von Actomyosin zu hemmen, verwendeten wir Y27632, den zellpermeablen Inhibitor der Rho-Kinase (ROCK), gekauft von Merck Millipore, in Wasser gelöst, um 10 mM Stammlösungen herzustellen und in Endkonzentrationen im Bereich von 50 bis 100 µM zu verwenden. Für Negativkontrollbehandlungen wurde eine identische Menge Wasser verwendet.

Um die Filamentbildung und Funktion von Nicht-Muskel-Myosin 2 A in A431-Epithelkarzinomzellen zu hemmen, haben wir sie mit menschlichen S100A4-Konstrukten transfiziert. DNA-Konstrukte, die entweder den Wildtyp oder einen inaktiven Mutanten exprimieren, wurden wie zuvor beschrieben hergestellt34. Der mutierten Form (MutS100A4), die mit der Megaprimer-Methode48 abgeleitet wurde, fehlen 13 Aminosäuren am C-Terminus und sie enthält eine Punktmutation in Position 81, die ein Cystein durch Serin ersetzt und daher die NM2-Assemblierung nicht hemmt. Sowohl die Wildtyp- als auch die Mutanten-S100A4-Kodierungssequenzen wurden in das pIRES2-eGFP-Plasmid (Clontech) subkloniert, das eine interne Ribosomeneintrittsstelle unter Verwendung der Restriktionsstellen XhoI und BamHI enthält. Unter Verwendung der BsaI-Restriktionsstelle zur Linearisierung wurden Zellen mit linearisierten Plasmiden transfiziert, wobei FuGene HD-Transfektionsreagenz (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Stabile Transfektanten wurden mit 0,4 mg/ml G418-Antibiotika (Merck Millipore) selektiert. Nach zweiwöchiger Selektion in mit G418 ergänztem Medium wurden stabil transfizierte Zellen anhand ihres GFP-Signals unter Verwendung des FACSAria Cell Sorter (BD Biosciences) weiter selektiert. Nach der Selektion wurden die Zellen in 0,2 mg/ml G418 gehalten. Schließlich wurden sechs S100A4-überexprimierende und fünf mutS100A4-überexprimierende Zellklone etabliert, von denen einer aus jeder Gruppe für Aggregations- und Segregationsstudien verwendet wurde.

Stabile A431-Transfektanten wurden in Zelllysepuffer (25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 1 % v/v Triton X-100 und 1 % v/v Proteaseinhibitor-Cocktail) lysiert. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Assay gemessen und 20 µg Gesamtproteinproben wurden auf SDS-PAGE unter Verwendung von 10 % Tris-Tricin-Gel analysiert. Die Proben wurden auf eine PVDF-Membran geblottet, dann wurde das S100A4-Protein mit einem Anti-S100A4-Antikörper (Maus, monoklonal, PR006.21.3, 1:1000-Verdünnung, eine freundliche Gabe von Dr. Jörg Klingelhöfer von der Universität Kopenhagen) und anschließend mit Meerrettichperoxidase konjugiert nachgewiesen Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:5000-Verdünnung, Santa Cruz). Zur Beladungskontrolle wurde Tubulin durch einen monoklonalen Anti-Tubulin-Antikörper (1:5000-Verdünnung, Sigma) und einen mit Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-Maus-Antikörper nachgewiesen. Chemilumineszenz wurde unter Verwendung von ECL Western Blotting Substrate (Pierce) nachgewiesen.

Die DPA wurde wie zuvor ausführlich beschrieben23 durchgeführt. Zusammenfassend wurden Einzelzellsuspensionen aus Monoschichtkulturen von Keratinozyten nach kurzer Inkubation in PBS und anschließendem Abwaschen in CO2-unabhängigem Medium (GIBCO) hergestellt und auf einer passivierten Glasbodenschale (Mattek) ausgesät. Die Zellen wurden unter Verwendung von Mikropipetten gesammelt, die aus Glaskapillaren (World Precision Instrument, TW100-3) hergestellt wurden, und unter Verwendung eines Mikronadelziehers (Sutter Instrument, P-97 Flaming Brown Mikropipettenzieher) zur Herstellung von Kapillaren mit einer Verjüngung von etwa 3,5 µm Innenradius gebogen 45°-Winkel (Microdata-Instrument, MFG-5) und passiviert mit hitzeinaktiviertem FBS (Invitrogen).

Die Mikropipetten wurden über zwei unabhängige Kanäle mit einem Unterdruck im Bereich von 7–750 Pa an ein mikrofluidisches Flusskontrollsystem (Fluigent, Fluiwell) angeschlossen, das auf zwei Mikromanipulatoren (Eppendorf, Transferman Nk2) montiert war, wobei die Mikropipettenbewegung und der Druck über ein individuell programmiertes System gesteuert wurden Labview-Schnittstelle (National Instruments). Für Zellmanipulationen ca. Es wurde ein Unterdruck von 20 Pa verwendet.

Nachdem die Zellen in Kontakt gebracht worden waren, ließ man die Dubletts eine Minute lang anhaften. Die anhaftenden Zellen wurden dann von zwei Mikropipetten (Halte- und Sondenpipetten) auf gegenüberliegenden Seiten des Zell-Zell-Kontakts erfasst. Die Haltemikropipette wurde verwendet, um eine Zelle mit einem festen Druck im Bereich von 10–5000 Pa festzuhalten. Die Sondierungsmikropipette wurde verwendet, um schrittweise ansteigende Drücke im Bereich von 2–10 Pa mit Schrittgrößen zwischen 0,5 und 3 Pa auf die andere Zelle auszuüben. Nach jedem Druckschritt wurden die Mikropipetten mit 20 µm/s auseinandergezogen, um die Kontaktzellen zu trennen. Sobald der angelegte Druck in der Sondenpipette hoch genug war, um die sich berührenden Zellen zu trennen, konnte die Trennkraft Fs aus dem Enddruck und dem Druck der letzten fehlgeschlagenen Trennung berechnet werden, wobei Fs = pi R2(Pn − 1 + Pn)/ verwendet wurde. 2 wobei R der Radius der Mikropipette ist, Pn der Druck ist, der von der Sondenpipette während des Trennschritts ausgeübt wird, und Pn − 1 der Druck ist, der während des Ziehschritts vor dem Trennschritt ausgeübt wird. Die Anzahl der Druckstufen wurde üblicherweise zwischen 1 und 3 gehalten.

Zelltrennungen wurden auf einem Zeiss Axiovert-Umkehrmikroskop abgebildet, das mit einem LD PlanNeoFluar 40x, 0,6 NA Ph2 Korr-Objektiv, einer CoolSnap HQ-Kamera (Photometrics) und einer auf 28 °C eingestellten Heizbox ausgestattet war. Die Kontaktwinkel der Zelldubletts wurden mit der NIH ImageJ-Software charakterisiert.

Zeitrafferaufnahmen mit Phasenkontrast- oder Doppelfluoreszenzanwendungen wurden mit einem inversen Zeiss Axio Observer Z1-Mikroskop mit Zeiss Plan Neofluar 10x, 0,3 NA-Objektiv, gekoppelt an eine Zeiss Axiocam MRM CCD-Kamera und ausgestattet mit einem Marzhauser SCAN-IM-Antriebstisch, durchgeführt. Zur Fluoreszenzanregung wurde das Zeiss Colibri LED-Beleuchtungssystem verwendet. Für die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie und fluoreszierende optische Schnitte verwendeten wir das Zeiss Apotome-Modul. Während der Zeitrafferaufnahme wurden die Zellkulturen in einem Tischinkubator (CellMovie) gehalten, der für die erforderliche Temperatur und CO2-Atmosphäre sorgte. Positionierung der Leistungsstufe, Beleuchtung, Fokussierung, optische Schnitte und Primärbilderfassung wurden durch die Zeiss Axiovision 4.8-Software und ein maßgeschneidertes Experimentmanager-Softwaremodul auf einem PC gesteuert. Die Bilder wurden mit der Software Zeiss Axiovision 4.8 und NIH ImageJ weiterverarbeitet.

Durch Phasenkontrast-Zeitraffermikroskopie aufgenommene Bilder wurden mit der NIH ImageJ-Software mit Plugins unseres Designs analysiert, verfügbar unter https://github.com/gulyasmarton/ContractilityAnalyzer.git. Für den Sphäroid-Aggregationstest wurden die Bilder mit einem Sobel-Operator zur Kantenerkennung und einem 5 Pixel breiten Gaußschen Unschärfefilter vorverarbeitet. Die vorverarbeiteten Bilder wurden mit dem Standard-ImageJ-Schwellenwerter (IsoData49) segmentiert. Das Segmentierungsrauschen wurde durch das Füllen von Löchern kleiner als 1000 Pixel reduziert. Das Sphäroid wurde als größte Ansammlung verbundener Pixel identifiziert. Indem wir diesen Vorgang für jedes Bild der Bildsequenz wiederholten, berechneten wir den zeitabhängigen Umfang des Sphäroids.

Um die durchschnittliche Größe von Clustern in fluoreszenzmikroskopischen Bildern zu charakterisieren, wurde eine Korrelationslängenanalyse wie zuvor beschrieben durchgeführt47. Es wurde die Korrelationslänge von Zweipunktkorrelationen verwendet. Es wurden nur Pixel mit Intensitäten über einem Schwellenwert berücksichtigt.

Zunächst ermittelten wir die Zweipunktkorrelationen für beide Farben in einem vorgegebenen Bereich (0–200 µm) und berechneten den Durchmesser der Cluster. Für kleine Entfernungen kann die Zweipunktkorrelation als quadratische Form der Entfernung angenähert werden:

wobei R0 den durchschnittlichen Durchmesser der Cluster bezeichnet und K ein Faktor ist, der normalerweise unbekannt ist

hängt von der Verteilung der Clusterformen ab. Durch Anpassen eines Polynoms an die Korrelationen erhielten wir die typische Größe eines Clusters.

Wenn statistische Analysen durchgeführt wurden, werden die relevanten Stichprobengrößen als Anzahl der analysierten unabhängigen Einheiten als n-Zahlen angegeben. Wenn statistisch signifikante Unterschiede als Ergebnis des Vergleichs der Mittelwerte zweier Datensätze angegeben werden, wurde der Student-t-Test mit einer ungepaarten Einstellung und der Annahme ungleicher Varianzen angewendet. Im Allgemeinen bezieht sich der angegebene p-Wert auf die zweiseitige P-Wahrscheinlichkeit (T <= t).

Für Diagramme, die das zeitabhängige Clustergrößenwachstum eines bestimmten Zelltyps während der Trennung von einem anderen Zelltyp zeigen, sind die Datenerfassungs- und Analyseprozesse die folgenden: Bildserien von Z-Stapeln von 2D-optischen Schnitten, die das gesamte Zellclustervolumen umfassen, sind einzeln einer Zweipunkt-Korrelationslängenanalyse unterzogen, die auf der Grundlage der Analyse von n > 1000 Punkten in einem einzelnen Bild lineare Clustergrößendaten liefert. Diese Analyse wird in allen Bildern des Z-Stapels der Zeitreihe wiederholt, die ursprünglich in 10-Minuten-Intervallen für verschiedene Gesamtdauern von 10 bis 50 Stunden aufgezeichnet wurde, was 60 bis 150 aufeinanderfolgende Datenpunkte ergibt, die für die gegebene Versuchsbedingung spezifiziert sind. Die Anzahl der auf diese Weise als unabhängige Einheiten analysierten Zellcluster (d. h. einzelne 3D-Zellkulturen) wird durch die Zahl n dargestellt, die der spezifischen Versuchsbedingung (Zelltyp, Behandlung) zugeordnet ist, und in der Legende des entsprechenden Abbildungsdiagramms enthalten. Diese Abbildungsdiagramme zeigen Mittelwerte +/− Standardfehler der Mittelwerte (SEM), die aus Clustergrößendaten berechnet wurden, die aus n > 1000 Datenpunkten gemittelt wurden, die in 6 bis 10 Z-Ebenen für n angegebene Anzahl unabhängiger Zellkulturen gemessen wurden, und diese werden angezeigt als einzelne Datenpunkte in Datenreihen mit einer Zeitreihe von 60 bis 150 Datenpunkten, abhängig vom konkreten Experiment. Einzelheiten finden Sie unter Ergänzende Daten 2 und Ergänzende Daten 4.

Bei Diagrammen, bei denen die enthaltenen Daten nicht zeitabhängig sind, wie z. B. Trennkraftdaten für Zelldubletts (Abb. 1) oder Kontaktwinkeldaten für Zelldubletts (Abb. 7), wurden die einzelnen Datenpunkte in Box- und Transformiert Whisker-Plots, die das Minimum, das untere Quartil, den Median, das obere Quartil und die Maximalwerte auf der Grundlage des fünfstelligen zusammenfassenden Satzes der deskriptiven Statistik angeben. Die jeweiligen Probennummern sind als n-Nummer der jeweiligen Datenquelle enthalten und werden in allen Fällen in den zugehörigen Abbildungslegenden angegeben. Einzelheiten finden Sie unter Ergänzende Daten 1 und Ergänzende Daten 5.

Wenn zeitabhängige Größendaten in Abbildungsdiagramme einbezogen werden, die den multizellulären Aggregationsprozess verschiedener Zelltypen darstellen, wie z. B. Abb. In den Abbildungen 4 und 8 wurde die folgende Datenerfassungs- und Analysemethode verwendet: Zeitraffer-Bildserien einzelner 3D-Zellkulturen wurden in 10-Minuten-Intervallen für eine Dauer von 10 bis 25 Stunden gesammelt, was jeweils Rohdatenserien von 60 bis 150 Datenpunkten ergab unabhängige Stichprobe, dargestellt als die in der entsprechenden Abbildungslegende enthaltene Zahl n. Für jede Datenreihe haben wir die Datenerfassung auf 1 Stunde mit 6 Zeitpunkten festgelegt, den Mittelwert +/– Standardfehler der Mittelwerte (SEM) berechnet und diese Werte in den entsprechenden Diagrammen dargestellt. Einzelheiten finden Sie in den Zusatzdaten 3.

Der Zugriff auf die numerischen Quelldaten für alle Diagramme erfolgt in Form von Datenblättern in den diesem Artikel beigefügten Zusatzdatendateien.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen Zusatzinformationen und Zusatzdatendateien enthalten.

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Wir danken Marton Gulyas (ELTE Eötvös University) für die Entwicklung des Videomikroskopie-Experimentmanagers und der Bildanalysesoftware. Die Autoren danken Gabor Forgacs (University of Missouri) für die kritische Lektüre früherer Versionen dieses Manuskripts sowie Zsuzsa Akos und Andras Czirok (ELTE Eötvös University) für fruchtbare Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom EU FP7, dem ERC COLLMOT-Projekt Nr. 227878 an TV, dem Nationalen Forschungsentwicklungs- und Innovationsfonds von Ungarn, K119359 und auch dem Projekt Nr. 2018-1.2.1-NKP-2018-00005 an LN unterstützt. Dieses Projekt wurde vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Sklodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 955576 gefördert. MV wurde durch das Ja´nos Bolyai-Stipendium der Ungarischen Akademie der Wissenschaften unterstützt.

Open-Access-Finanzierung durch die Eötvös-Loránd-Universität.

Abteilung für biologische Physik, ELTE Eötvös-Universität, Budapest, Ungarn

Elod Méhes, Enys Mones & Tamás Vicsek

Abteilung für Genetik, ELTE Eötvös-Universität, Budapest, Ungarn

Máté Varga & Zsigmond Áron

Abteilung für Biochemie, ELTE Eötvös Universität, Budapest, Ungarn

Beáta Biri-Kovács & László Nyitray

Zentrum für Marine Biotechnologie und Biomedizin, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Vanessa Barone

Institut für Wissenschaft und Technologie Austria, Klosterneuburg, Österreich

Vanessa Barone, Gabriel Krens & Carl-Philipp Heisenberg

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EM und TV konzipierten das Projekt und gestalteten die Experimente, schrieben das Manuskript; EM führte die Experimente mit Unterstützung von MV, AZ und GK für Zebrafischexperimente, BB-K, durch. und LN für S100A4-Genmanipulationen; VB und E.Méhes führten DPA-Experimente durch; EM führte mit Unterstützung von E.Mones eine Datenanalyse zur Clustergrößenanalyse durch; C.-PH trug zur Interpretation der Studiendaten bei. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Tamás Vicsek.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Nicholas Kurniawan und Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Méhes, E., Mones, E., Varga, M. et al. Die Geometrie und Dynamik der 3D-Zellsegregation wird durch die Regulierung der Gewebeoberflächenspannung gesteuert. Commun Biol 6, 817 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05181-7

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Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05181-7

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